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ELISA即酶联免疫吸附实验，是目前广泛应用于各种抗原抗体检测的方法，主要有灵敏度高和特异性强的特点。ELISA操作步骤看似简单，整个测定过程中却有诸多影响因素，导致检测结果可能与实际结果偏差较大。为帮助大家分析实验中常见问题，我们将常见问题的可能原因和解决方法归纳总结于下表：
问题一：高背景或阴性对照值偏高
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可能原因 |
建议 |
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阴性对照孔被阳性对照或样品污染 |
洗涤时，勿将洗液溢出孔外。 |
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洗涤不充分 |
确保在洗涤时每个孔都充满了液体，确保将残余液体从孔中移除。 |
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酶结合物过浓 |
请检查酶结合物是否按说明书规定稀释 |
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孵育温度过高 |
检查孵育箱的温度是否正确、稳定 |
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底物在使用前曝光 |
应保存在暗处，避光。 |
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读板前停留时间过长 |
加终止液后3分钟内读数 |
问题二：阳性对照值偏低或低吸光度
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可能原因 |
建议 |
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蒸发 |
各步之间，须使用封版胶密封反应板。 |
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温度不均匀 |
校准孵育箱，勿叠放反应板。 |
问题三：边缘效应
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可能原因 |
建议 |
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蒸发 |
各步之间，须使用封版胶密封反应板 |
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温度不均匀 |
校准孵育箱，勿叠放反应板 |
问题四：标准曲线不佳
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可能原因 |
建议 |
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倍比稀释标准品时未混匀 |
稀释标准品的每一步均需混匀 |
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过早稀释 |
标准品在快要使用时稀释 |
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加入的体积不正确 |
使用校准过的移液器，快速、等量的将标准品分配到各个微孔中 |
问题五：标准曲标准曲线良好，但样本无检测信号
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可能原因 |
建议 |
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样本中无检测物或检测物含量极低 |
设置内参，重新实验 |
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样本中其他物质影响/掩盖检测 |
作适当稀释，降低其他物质的干扰，或作系列稀释，检测回收率。 |
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样本中检测物浓度过高，Hook效应导致假低值 |
适当倍数稀释样本，检测物浓度尽量在试剂盒检测范围内。 |
问题六：重复性较差
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可能原因 |
建议 |
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微孔中有气泡 |
用针尖挑破气泡 |
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试剂未混匀 |
确保充分混匀试剂 |
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样本中有杂质或沉淀物 |
使用前离心 |
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微孔包被面被吸头划破 |
加液时小心操作 |
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使用用过的封板胶纸 |
每次须使用新的封板胶封住反应孔 |
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