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ELISA操作常见问题和解决方法
来源:Genenode|君诺德公司     发布时间:2016-04-16     Hits:3348

ELISA即酶联免疫吸附实验,是目前广泛应用于各种抗原抗体检测的方法,主要有灵敏度高和特异性强的特点。ELISA操作步骤看似简单,整个测定过程中却有诸多影响因素,导致检测结果可能与实际结果偏差较大。为帮助大家分析实验中常见问题,我们将常见问题的可能原因和解决方法归纳总结于下表:

 

问题一:高背景或阴性对照值偏高

可能原因

建议

阴性对照孔被阳性对照或样品污染

洗涤时,勿将洗液溢出孔外。

洗涤不充分

确保在洗涤时每个孔都充满了液体,确保将残余液体从孔中移除。

酶结合物过浓

请检查酶结合物是否按说明书规定稀释

孵育温度过高

检查孵育箱的温度是否正确、稳定

底物在使用前曝光

应保存在暗处,避光。

读板前停留时间过长

加终止液后3分钟内读数

 

问题二:阳性对照值偏低或低吸光度

可能原因

建议

蒸发

各步之间,须使用封版胶密封反应板。

温度不均匀

校准孵育箱,勿叠放反应板。

 

问题三:边缘效应

可能原因

建议

蒸发 

各步之间,须使用封版胶密封反应板

温度不均匀 

校准孵育箱,勿叠放反应板

 

问题四:标准曲线不佳 

可能原因

建议

倍比稀释标准品时未混匀 

稀释标准品的每一步均需混匀

过早稀释

标准品在快要使用时稀释

加入的体积不正确

使用校准过的移液器,快速、等量的将标准品分配到各个微孔中

 

问题五:标准曲标准曲线良好,但样本无检测信号

可能原因

建议

样本中无检测物或检测物含量极低

设置内参,重新实验

样本中其他物质影响/掩盖检测

作适当稀释,降低其他物质的干扰,或作系列稀释,检测回收率。

样本中检测物浓度过高,Hook效应导致假低值

适当倍数稀释样本,检测物浓度尽量在试剂盒检测范围内。

 

问题六:重复性较差

可能原因

建议

微孔中有气泡

用针尖挑破气泡

试剂未混匀

确保充分混匀试剂

样本中有杂质或沉淀物

使用前离心

微孔包被面被吸头划破

加液时小心操作

使用用过的封板胶纸

每次须使用新的封板胶封住反应孔