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核酸、蛋白质杂交用相关试剂、缓冲液的配制方法

20×SSC   

组份浓度 3.0 MNaCl，0.3 MNa3citrate·2H2O(柠檬酸钠·2H2O)

配制量   1 L

配制方法  

1.称量下列试剂，置于l L烧杯中。

NaCl	175.3 g
柠檬酸钠·2H2O	88.2 g

2.向烧杯中加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。

3.滴加14 N HCl，调节pH值至7.0后，加去离子水将溶液定容至1 L。

4.高温高压灭菌后，室温保存。

20×SSPE Buffer 

组份浓度 3.0 MNaCl，0.2 MNaH2PO4，0.02 MEDTA

配制量    1.L

配制方法  

1.称量下列试剂，置于l L烧杯中。

NaCl	175.3 g
NaH2PO4·H2O	27.6 g
Na2EDTA·2H2O	7.4 g

2.向烧杯中加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。

3.加NaOH调节pH值至7.4(约6.5 ml的10 N NaOH)。

4.加去离子水将溶液定容至l L。

5.高温高压灭菌后，室温保存。

50 X Denhardt’S溶液 

组份浓度

1%(W/V)	Ficoll 400(菲可400/水溶性聚蔗糖400)
1%(W/V)	Polyvinylpyrrolidone(聚维酮/聚乙烯吡咯烷酮)
1%(W/V)	BSA

配制量    500 ml

配制方法  

1.称量下列试剂，置于500 ml烧杯中。

Flcoll 400	5 g
Polyvinylpyrrolidone	5 g
BSA	5 g

2.加去离子水约400 ml，充分搅拌溶解

3.加去离子水将溶液定容至500 ml。

4.用0.45µm滤膜过滤后，分装成每份25 ml。

5.-20℃保存。

0.5 M 磷酸盐Buffer 

组份浓度 0.5 M Na2HPO4。

配制量    l L

配制方法  

1.称量134 gNa2HPO4·7H2O置于1 L烧杯中。

2.加入约800 ml的去离子水充分搅拌溶解。

3.加入85%的H3PO4(浓磷酸)调节溶液pH值至7.2。

4.加去离子水定容至1 L。

5.高温高压灭菌后，室温保存。

Salmon DNA  (鲑鱼精DNA)  

组份浓度  10 mg/ml Salmon DNA

配制量    约100 ml

配制方法 

1.称取鲑鱼精DNA2 g置于500 ml烧杯中，加入约200 ml的TE Buffer。

2用磁力搅拌器室温搅拌2~4h,溶解后加入4ml的5 MNaCl，使其终浓度为0.1 M。

3.用苯酚和苯酚/氯仿各抽提1次。

4.回收水相溶液后，使用17号皮下注射针头快速吸打溶液约20次，以切断DNA。

5.加入2倍体积的预冷乙醇进行乙醇沉淀。

6.离心回收DNA后，溶解于100 ml的去离子水中。测定溶液的OD260值。

7.计算溶液的DNA浓度后，稀释DNA溶液至10 mg/ml。

8.煮沸10min后，分装成小份(1 ml/份)。-20℃保存。

9.使用前在沸水浴中加热5min后，迅速冰浴冷却。

DNA变性缓冲液

组份浓度 1.5 MNaCl，0.5 MNaOH

配制量   1 L

配制方法  

1.称量下列试剂，置于l L烧杯中。

NaCl	87.7 g
NaOH	20 g

2.向烧杯中加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。

3.加去离子水将溶液定容至l L后，室温保存。

预杂交液/杂交液 (DNA杂交用)

组份浓度

6×	SSC(或SSPE)
5×	Denhardt’s
0.5%(W/V)	SDS
100 µg/ml	Salmon DNA

 配制置    100 ml

 配制方法 

1.称量下列试剂，置于200 ml烧杯中。

20×SSC(或SSPE)	30 ml
50×Denhardt’s	10 ml
10% SDS	5 ml
10 mg/ml Salmon DNA	1 ml
dH2O	54 ml

2.充分混匀后，使用0.45 µm滤膜滤去杂质后使用。

预杂交液/杂交液(RNA杂交用)

组份浓度

6×	SSC(或SSPE)
5×	Denhardt‘s
0.5%(W/V)	SDS
100 g/ml	Salmon DNA
50%(V/V)	Formamlde(甲酰胺)

配制量    100 mL

配制方法  

1.称量下列试剂，置于200 ml烧杯中。

20×SSC(或SSPE)	30 ml
50×Denhardt’s	10 ml
10% SDS	5 ml
10 mg/ml Salmon DNA	1 ml
Formamide(甲酰胺)	50 ml
dH2O	4 ml

2.充分混匀后，使用0.45µm滤膜滤去杂质后使用。

膜转移缓冲液(Western杂交用) 

组份浓度 39 mMGlycine，48 mMTris，0.037%(W/V)SDS，20%(V/V)甲醇

配制量   1 L

配制方法  

1.称量下列试剂，置于l L烧杯中。

Glycine	2.9 g
Tris	5.8 g
SDS	0.37 g

2.向烧杯中加入约600 ml的去离子水，充分搅拌溶解。

3.加去离子水将溶液定溶至800 ml后，加入200 ml的甲醇。

4.室温保存。

TBST Buffer(Western杂交膜清洗液) 

组份浓度 20 mMTris-HCl，150 mMNaCl，0.05%(V/V)Tween 20

配制量   1 L

配制方法  

1.称量下列试剂，置于l L烧杯中。

NaCl	8.8 g
1 MTris-HCl(pH8.0)	20 ml

2.向烧杯中加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。

3.加入0.5 ml Tween 20后充分混匀。

4.加去离子水将溶液定容至l L后，4℃保存。

封闭缓冲液(Western杂交用)

组份浓度  5%(W/V)脱脂奶粉/TBST Buffer

配制量    100 ml

配制方法  

1.称5 g脱脂奶粉加入到100 ml TBST Buffer中，充分搅拌溶解。

2. 4℃保存待用(本封闭液应该现配现用)。