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nfo DNA恒温快速扩增试剂盒(试纸条型)
nfo DNA Isothermal Amplification kit(39℃)

一.原理概述
本试剂盒基于一种常温恒温核酸快速扩增技术：在常温恒温下，重组酶和引物形成蛋白/单链核苷酸的复合体Rec/ssDNA，在辅助蛋白和单链结合蛋白SSB的帮助下，侵入双链DNA模板；在侵入位点形成D‑loop区域，并开始对DNA双链进行扫描；待找到与引物互补的目的区域后，复合体Rec/ssDNA解体的同时，聚合酶也结合到引物的3’末端，开始链的延伸。依赖nfo酶的作用，加入根据模版设计的特异的分子探针，使用胶体金技术（三明治夹心法）可以对最终结果进行检测。

二.产品特点
本试剂盒具有灵敏度高、特异性强、反应时间短（仅需15 mins）等优点，反应组分为干粉状态，操作简便，易于保存。
本试剂对设备要求低，金属浴、水浴锅等即可进行反应操作，无需购买PCR扩增仪等价格高昂的专属设备。

三.引物设计
1. 建议使用长度在30‑35 bp的引物，引物过长或过短会影响扩增速度和检测灵敏度（特殊情况下设计较长引物比较困难的序列，引物长度可缩短至25 bp，但最好不少于25 bp）；
2. 碱基排布随机性高，GC 含量在 30%‑70%之间；
3. 下游引物的5’端标记一个修饰基团（常用生物素Biotin）；
4. 引物设计避免形成二级结构而影响扩增；
5. 引物Tm值不作为设计时主要考虑因素；
6. 扩增子长度建议在150‑300 bp，通常不超过500 bp。
7. 最佳引物对需通过试验优化筛选，要求其扩增产物为单一条带，无非特异性扩增和明显的引物二聚体。

四.荧光探针设计
1.在上下游引物中间，设计一段长度为46‑52nt与目的片段互补的序列作为荧光探针；
2.探针序列不与特异性引物识别位点重叠，长度为46‑52 nt，序列避免回文序列、内部二级结构和连续的重复碱基。

3.探针共有四个修饰位点：
1). 5’端修饰一个抗原标记（FAM）；
2). 在距 5’端约30nt序列位置上标记一个dSpacer（THF，四氢呋喃），作为nfo的识别位点；
3). THF距离3’末端约15 nt，并且3’末端标记一个修饰基团，例如胺基、磷酸基团或 C3‑spacer。

引物探针修饰示例：
1.上下游引物修饰示例：
下游引物序列：5’‑CGCTGACTGCGTGCATGACCGTACCAACCG‑3’
下游引物修饰：[5’‑biotin]‑CGCTGACTGCGTGCATGACCGTACCAACCG‑3’
2.探针修饰示例：
5’ATGGCTATCATATCGCATAACTGCCGACAGTAGCTCTCAAAGATGGACC‑3’
探针修饰：
[5’FAM]‑ATGGCTATCATATCGCATAACTGCCGACAGTAG[THF]TCTCAAAGAT
GGACC‑[3’C3spacer]



五.试剂盒组成：

产品组成	包装规格
A Buffer	1.5 mL×1管
B Buffer	200 μL×1管
干粉反应管	48份(6个8联排)
使用说明书	1份

六.试剂盒储存：
运输条件：低温运输；产品有效期：12个月。
储存条件：储存温度 ≤ ‑20 ºC，避光保存，避免重压、反复冻融；

七.操作步骤：提前30分钟将试剂盒所需组分取出，室温融化，震荡混匀。
1.根据待检测样本总数，设所需要的反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照)，每测试反应体系配制如下表：

组分	待测样品
A Buffer	25 μL
上游引物(10 μM)	2 μL
下游引物(10 μM)	2 μL
探针引物(10 μM)	0.6 μL
ddH2O	12.9 μL

2.在1.5 mL无菌离心管中加入上述试剂，充分振荡混匀后瞬时离心10sec，按照42.5 
μL/管分装量，将试剂分装至八联排干粉反应管中。

3.将待测样品DNA取5 μL，加入相应的反应管中，盖好管盖，核酸加样过程中应避免污染。

4.最后在反应管盖子中加入2.5 μL的B Buffer，盖上管盖，上下颠倒轻甩反应管8‑10次进行混匀，充分混匀后瞬时离心10 sec；(注：是否充分混匀，将决定实验结果的重复性)

5.混匀后，将反应液甩（或快速离心）至管子底部，然后立即将反应管放入恒温设备(恒温金属浴，恒温水浴锅和恒温培养箱)中39 ℃孵育15‑20 mins；

6.反应结束后，取10 μL加入含有190 μL ddH2O的离心管中（扩增产物稀释10‑20倍），混合均匀后，吸取50‑100 μL稀释的产物滴加在胶体金卡点样孔中3‑5 mins，观察质控线与检测线判读结果。(本步骤需在通风柜中操作，避免气溶胶污染)

八.注意事项
1.试剂盒保质期12个月。每次使用时，请取出实验所需的反应单元的数量，置于冰浴条件下并在8小时内使用；剩余部分，请置于存储条件下。
2.当实验室环境、试剂、仪器或配件存在阳性物质污染，或样本间存在交叉污染的情况，则会影响检测结果准确性，出现假阳性结果；
3.由于试剂盒灵敏度非常高，在进行反应时请注意避免DNA污染，并尽量考虑设置空白对照以确认是否有待扩增DNA的污染。
4.请严格按照本说明书和基因扩增实验室的管理规范进行试验操作；
5.样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；
6.实验完毕后用10%次氯酸或75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；
实验结束后，检测过程中所产生的废弃物应按照相关规范进行处理；