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nfo DNA恒温快速扩增试剂盒(试纸条型)

包装规格：

用于DNA扩增，试纸条检测

配套使用产品：

一. 原理概述：
本试剂盒基于一种常温恒温核酸快速扩增技术：在常温恒温下，重组酶和引物形成蛋白/单链核苷酸的复合体Rec/ssDNA，在辅助蛋白和单链结合蛋白SSB的帮助下，侵入双链DNA模板；在侵入位点形成D-loop区域，并开始对DNA双链进行扫描；待找到与引物互补的目的区域后，复合体Rec/ssDNA解体的同时，聚合酶也结合到引物的3’末端，开始链的延伸。依赖nfo酶的作用，加入根据模版设计的特异的分子探针，使用胶体金技术（三明治夹心法）可以对最终结果进行检测。

二. 产品特点：
本试剂盒具有灵敏度高、特异性强、反应时间短（仅需12 mins）等优点，反应组分为干粉状态，操作简便，易于保存。
本试剂对设备要求低，金属浴、水浴锅等即可进行反应操作，无需购买PCR扩增仪等价格高昂的专属设备。

三. 引物设计：
1. 建议使用长度在 30-35 bp的引物，引物过短会影响扩增速度和检测灵敏度；

2. 碱基排布随机性高，GC 含量在 30%-70%之间；

3. 下游引物的5’端标记一个修饰基团（常用生物素Biotin）；

4. 引物设计避免形成二级结构而影响扩增；

5. 扩增子长度建议在150-300 bp，通常不超过500 bp。

四. 荧光探针设计：
在上下游引物中间，设计一段长度为 46-52nt 与目的片段互补的序列作为胶体金探针；
探针序列不与特异性引物识别位点重叠，长度为 46-52 nt，序列避免回文序列、内部二级结构和连续的重复碱基。

探针共有三个修饰位点：
1. 5’端修饰一个抗原标记（FAM）；
2. 在距 5’端约 30nt 序列位置上标记一个 dSpacer（四氢呋喃，THF），作为 nfo 的识别位点；
3. THF 距离 3’末端约 15 nt，并且 3’末端标记一个修饰基团，例如胺基、磷酸基团或 C3-spacer。

提前30分钟将试剂盒所需组分取出，室温融化，震荡混匀。
1).每个干粉反应管加入32.9 μL A buffer（注意：A buffer需完全融化混匀，否则会对实验效果产生影响）；

2).每个反应管分别加入2 μL上游引物、2 μL下游引物和0.6 μL探针（引物和探针浓度为10 μM，对于多个反应、步骤1和步骤2可以混合后再分装至反应管中）；

3).向反应管中依次加入5 μL ddH2O和5 μL核酸模板（可根据核酸浓度调整加入的核酸模板体积，并相应调整加入的ddH2O体积，至模板与ddH2O总体积为10 μL）；

4).最后向反应管中加入2.5 μL B Buffer并充分混合（对于多个反应，建议将B Buffer加至反应管的盖子内侧，上下颠倒反应管8-10次混匀）；

5).混匀后，将反应液甩（或快速离心）至管子底部，然后立即将反应管放入恒温设备中37-39 ºC孵育8-12 mins；

6).反应结束后，取10 μL加入含有190 μL ddH2O的离心管中，混合均匀后，吸取 50uL稀释的产物滴加在胶体金卡点样孔中3-5 mins，观察质控线与检测线判读结果。

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