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Exo-DNA恒温快速扩增试剂盒(荧光型)

包装规格：

用于DNA扩增，荧光检测

一. 原理概述：
本试剂盒基于一种常温恒温核酸快速扩增技术：在常温恒温下，重组酶和引物形成蛋白/单链核苷酸的复合体Rec/ssDNA，在辅助蛋白和单链结合蛋白SSB的帮助下，侵入双链DNA模板；在侵入位点形成D-loop区域，并开始对DNA双链进行扫描；待找到与引物互补的目的区域后，复合体Rec/ssDNA解体的同时，聚合酶也结合到引物的3’末端，开始链的延伸。本试剂盒在39 ºC下，依赖核酸外切酶的作用，加入根据模版设计的特异的分子探针，使用荧光监测设备能实现对目标片段扩增过程的实时监控。

二. 产品特点：
本试剂盒具有灵敏度高、特异性强、反应时间短（仅需20 mins）等优点，反应组分为干粉状态，操作简便，易于保存。

可适用于各种品牌的荧光定量PCR仪、恒温荧光扩增仪器等荧光检测设备。

三. 引物设计：
1. 建议使用长度在30-35 bp的引物，引物过短会影响扩增速度和检测灵敏度；

2. 碱基排布随机性高，GC 含量在 30%-70%之间；

3. 引物设计避免形成二级结构而影响扩增；

4. 扩增子长度建议在150-300 bp，通常不超过500 bp。

四. 荧光探针设计：
在上下游引物中间，设计一段长度为 46-52nt 与目的片段互补的序列作为荧光探针；

探针序列不与特异性引物识别位点重叠，长度为46-52 nt，序列避免回文序列、内部二级结构和连续的重复碱基。

探针共有四个修饰位点：

1. 距离 5’端的 30-35 nt 的中部位置标记一个 dSpacer（四氢呋喃，THF），作为核酸外切酶的识别位点（任何碱基，无特殊要求）；
2. THF 位点的上游的 T 碱基上标记一个荧光基团（如 FAM），下游在 T 碱基上标记一个淬灭基团（如BHQ1），两个基团的间距为 2-4 nt；
3. THF 距离 3’末端约 15 nt，并且 3’末端标记一个修饰基团，例如胺基、磷酸基团或 C3-spacer。

五. 试剂盒储存：
运输条件：低温运输；
储存条件：储存温度 ≤ -20 ºC，避光保存，避免重压、反复冻融；
产品有效期：12个月。 

六. 操作步骤：

提前30分钟将试剂盒所需组分取出，室温融化，震荡混匀。

1.  每个干粉反应管加入32.9 μL A buffer（注意：A buffer需完全融化混匀，否则会对实验效果产生影响）；

2.  每个反应管分别加入2 μL上游引物、2 μL下游引物和0.6 μL探针（引物和探针浓度为10 μM，对于多个反应、步骤1和步骤2可以混合后再分装至反应管中）；

3.  向反应管中依次加入8 μL ddH2O和2 μL核酸模板（可根据核酸浓度调整加入的核酸模板体积，并相应调整加入的ddH2O体积，至模板与ddH2O总体积为10 μL）；

4.  最后向反应管中加入2.5 μL B Buffer并充分混合（对于多个反应，建议将B Buffer加至反应管的盖子内侧，上下颠倒反应管8-10次混匀）；

5.  混匀后，将反应液甩（或快速离心）至管子底部，然后立即将反应管放入荧光检测设备中。荧光检测程序设置为：恒温39 ºC预热1min，恒温扩增39 ºC，30sec/循环，40个循环，每30 sec采集一次FAM通道（信号采集通道的选择与荧光探针设计一致）荧光值；反应时间20 min。
注：如使用ABI系列PCR仪，请务必于passive reference和quencher处均选择“none”。

*正对照反应单元体系配制：阳性/阴性对照模板加入2μL，正对照引物探针C Buffer（包含探针和上/下游引物）加入4.6 μL，其他组分参照体系配制A Buffer 32.9 μL，ddH2O 8 μL，B Buffer 2.5 μL，总体积50 μL。

注意事项：
1．由于试剂盒灵敏度非常高，在进行反应时请注意避免微量待扩增DNA的污染，并尽量考虑设置空白对照以确认是否有待扩增DNA的污染。

2．试剂盒保质期12个月。每次使用时，请取出实验所需的MIRA反应单元的数量，置于冰浴条件下并在8小时内使用；剩余部分，请置于存储条件下。