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Multi One Step Cloning Kit
一步法同源重组定向克隆试剂盒(单/多片段连接)

包装规格：

编号	产品名称	规格	目录价
V6006-25	Multi One Step Cloning Kit一步法同源重组定向克隆试剂盒(单/多片段连接)	25T	1000
V6006-50	Multi One Step Cloning Kit一步法同源重组定向克隆试剂盒(单/多片段连接)	50T	1600
V6006-100	Multi One Step Cloning Kit一步法同源重组定向克隆试剂盒(单/多片段连接)	100T	3000

产品介绍：
Multi One Step Cloning技术是一种简单、快速并且高效的DNA无缝克隆技术。本试剂盒能通过识别DNA片段和线性化载体末端20个碱基的同源序列来将DNA片段不经酶切，定向克隆到目的载体的任意位置上。将线性化载体和目的片段按一定比例混合后，通过One Step Cloning的催化，仅需反应15-60min即可进行重组反应，完成定向克隆。

1. 可以将DNA片段克隆到载体的任意位点。
2. 可以同时重组克隆1-5个DNA片段到载体上。
3. 重组反应不依赖连接酶，降低自连背景 。
4. 可以成功重组80bp-50kb的DNA片段到载体上。

产品储存：

-20℃保存，避免反复冻。

产品特点：
1.30分钟可以将一个或者多个长、短PCR扩增片段（平端、A端均可）插入载体。
2.不受载体和插入片段酶切位点的可用性和平端/粘性末端的限制，可以在任意位点进行克隆。
3.无缝克隆，插入点不会引入不需要的碱基序列。
4.高效、准确，阳性率＞95% 。

适用范围：

适用于快速克隆，定向克隆，定点突变。

实验示意图：

实验前准备：
1. 重组引物设计：

重组引物的设计是Multi One Step Cloning成功的关键。

重组引物设计的原则为:
1. 引物5’端需要包含与将要连接的载体末端完全同源的15-20个碱基，退火温度处于50°C-65°C之间；
2. 引物3’端需要包含靶基因特异引物序列。通过该原则设计的引物扩增，可使片段与片段间，或者片段与引物间产生15-20bp相互同源的序列。其次在设计重组引物时要考虑避免引物自身或上下游引物间形成发夹结构或者产生引物二聚体，以免影响下游实验。

具体设计原则如下：
1.引物重组臂区域TM值参考范围控制在45℃-65℃之间。
2.与载体互补的引物重组臂序列应尽量减少自身重复或与载体附近有连续重复情况，不然会导致重组失败或错误重组出现。

2. DNA片段的制备：
DNA片段制备过程中可以使用任意的PCR酶工具（Taq酶或高保真酶）进行实验，Taq酶扩增产生的PolyA不会影响正确重组，但为了减少潜在的突变风险，建议使用高保真酶进行DNA片段的制备。

PCR产物可以通过柱回收试剂盒或胶回收试剂盒来纯化。如果PCR产物特异性不好，就必须通过凝胶回收试剂盒来回收正确的PCR产物，以确保正确的DNA片段被克隆目的载体上。

3. 线性化载体的制备：
重组克隆前，需要选择目标载体合适的位置进行线性化，推荐尽量选择无重复序列且GC含量较均一的区域进行重组克隆。线性化载体可以通过酶切或反向PCR获得，两者都需要通过柱回收试剂盒或凝胶回收试剂盒回收。因为内切酶酶切效率不高和反向PCR带入的环状质粒都会使得载体线性化不彻底，从而导致克隆实验假阳性克隆多，因此增加酶切时间，增大酶切体系或减少反向PCR扩增时加入的质粒模板量会减少假阳性背景的出现。

实验操作步骤：

1. 重组反应组分及用量：

组分	反应数量	阳性对照
2 × Cloning Master Mix	5ul	5ul
insert片段	50-300ng*	4.5 ul
Linear Vector线性化载体	20-150ng*	3 ul
去离子水	to 10ul	0.5 ul

2. 按照下表建立反应体系（可使用PCR管在冰上操作）：

2 × Cloning Master Mix	5 μl(最后加入)
Linear Vector (10-80 ng)	X μl*
Insert(s)	Y μl*
dd H2O	To 10 μl

* 对于最佳重组体系，插入片段的质量应该是线性化载体的质量的2倍。
* 对于载体或插入片段较大时 (>10K), 你可以将重组反应体系增加到 20ul，线性化载体和片段使用量要翻倍加入。

3. 使用移液器轻轻吸打混匀(请勿振荡混匀)，短暂离心将反应液收集至管底。

4. 将重组反应至于50°C孵育30-60分钟，然后置于冰上或放于-20°C保存，直到转化准备工作完成。

5. 将新鲜感受态细胞放于冰上缓慢解冻。

6. 取5-10ul反应产物加入到100ul感受态细胞中。轻混匀并放置于冰上静置30分钟。

7. 将含有反应液的感受态细胞放入水浴锅中42°C 热击90 秒。

8. 立即放置于冰上5分钟。

9. 将800ul SOC或LB培养基（不含抗生素）添加到感受态细胞中。

10. 将单管放入37°C摇床中220 rpm摇菌60分钟。

11. 5000rpm离心5 分钟, 丢弃大约750ul上清液. 轻悬剩余细胞液。

12. 使用涂布棒将转化液涂匀在含有相应抗生素的LB平板上，37°C倒置孵育12-16h。

13. 重组反应鉴定：
建议通过使用阳性对照和阴性对照实验来检验试剂盒组分是否保持正常功能。通常情况下，阳性对照平板能得到几百个克隆，而阴性对照平板克隆数要远远少于阳性克隆数。阳性插入片段需要通过菌落PCR实验来进行筛选，正常情况下阳性率都能达到90%以上，可再阳性菌液接种至含有适当抗生素的液体LB培养基中培养过夜，再提取质粒进行一代测序和酶切鉴定。