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One Tube Mutagenesis Kit 一管式突变试剂盒

产品介绍：
本定点突变试剂盒是基于PCR原理向目的DNA片段（一般为质粒）中引入碱基的点突变，多个邻近密码子的突变，单个或多个邻近密码子的缺失(deletion)或插入(insertion)等。一般宿主菌培养扩增的质粒DNA是甲基化的，PCR扩增新合成的DNA是非甲基化的。首先以待突变的甲基化质粒为模板，利用高保真的SuperPfu聚合酶实现突变质粒的合成（非甲基化，包含突变点，且有两个缺刻点nick点），再利用Dpn I酶选择性降解甲基化的模板质粒 ，剩下的新合成非甲基化的突变质粒转入大肠杆菌后，质粒中有两个nick位点可以被大肠杆菌修复，得到的克隆就会含有预期的突变质粒了。一般可以产生大于90%的突变效率。

产品储存：－20℃ 保存，有效期12个月。由于试剂盒中提供的反应缓冲液及dNTP等成份是为反应专门优化的，所以不要用其它的反应缓冲液及dNTP等代替。

适用范围：< 10kb甲基化质粒中核苷酸的突变。


特点：简单，一个PCR管中完成所有操作；采用部分重叠引物设计，使PCR呈指数扩增，扩增产物凝胶电泳可见；使用Dpn I去除非突变模板，突变效率高达90%。

引物设计：
1、引物包含5'端重叠区和3'端延伸区。5'端重叠区长度大约25-30bp，3'端延伸区长度大约是10-15bp。
2、突变位点设计在5'端重叠区的中间位置，突变位点的左侧5'端大约10-15bp,右侧3'端20-25bp。
3、计算引物的Tm值，看是否达到78℃，如果Tm值低于78℃，则适当改变引物的长度以使其Tm值≥78℃。
定点突变Tm值计算公式：Tm=81.5+0.41×(%GC)–675/L-%mismatch 
注：L：引物碱基数；%GC：引物GC含量百分数；%mismatch：突变位点数/引物长度数的百分数。
缺失或者插入Tm值计算公式：Tm=81.5+0.41×(%GC)–675/L 
注：L：引物碱基数，不包括插入碱基或者缺失碱基数；%GC：引物GC含量百分数
4、引物应该选择PAGE或者更高的纯化方式，GC含量应大于40%，3'端为一个或者更多个G/C结尾。
5、举例：GCGATT连续突变前4个碱基成为AAGCTT（引入一个Hind III酶切位点）
建议PCR反应条件（以25μl为例）：

Template	10-20ng
Forward Primer (10 μM)	1 μl
Reverse Primer (10 μM)	1 μl
10×SuperPfu  Buffer	2.5 μl
10 mM dNTPs	1 μl
SuperPfu DNA Polymerase	0.5 μl
ddH2O to final volume	25 μl

注意：如质粒大于4kb，dNTPs使用量为2μl

PCR循环：

电泳检测：
取5μl PCR产物，1% 琼脂糖凝胶电泳检测。如能看见目的条带，则已成功大半；注意即使未见条带或者见到目的条带外还有其它条带，也可以继续进行后续步骤。

PCR产物的消化：
直接加 0.5μl Dpn I酶于PCR产物中（约20μl），充分混匀，继续PCR仪器上37 ℃孵育1小时（不用热盖）。
注意：Dpn I含甘油，易沉底，一定要吹打混匀。如果非突变质粒较多，可以延长消化时间到3-5小时。

转化：
加入5-10μl Dpn I酶消化产物于50μl-100μl感受态细胞中(效率≥10的8次方)，轻弹混匀，冰浴30 分钟。按照标准转化步骤转化，最后将菌液铺板，培养过夜（为得到较多的克隆，4000 rpm 离心1min，弃掉部分上清，保留100-150μl，轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板，培养过夜）。
注意：如无克隆生长，或克隆数少，把Dpn I酶消化后的产物用常规的乙醇沉淀浓缩，这样就可以把所有的产物全部用于转化。