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Annexin V-Alexa Fluor647/PI Kit凋亡检测试剂盒

包装规格：

17106-50	Annexin V-Alexa Fluor647/PI Kit凋亡检测试剂盒	50T	1060元
17106-100	Annexin V-Alexa Fluor647/PI Kit凋亡检测试剂盒	100T	1820元

产品简介:

细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜内转移到细胞膜外，使PS暴露在细胞膜外表面。PS是一种带负电荷的磷脂，正常主要存在于细胞膜的内面，在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使PS暴露在细胞膜外。Annexin V具有易于结合到磷脂类如PS的特性，对PS有高度的亲和性。因此，该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的PS。PS转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。因此，可以采用AnnexinV与PI双染的方法，通过流式检测细胞早期凋亡。

储存条件:
2-8℃避光保存,勿冰冻。

注意事项:
本试剂盒需使用流式细胞仪进行检测。
此产品仅供研究，不用于临床诊断。

试剂盒组份： 
1.结合缓冲液 4x(Binding Buffer4x)
体积：
50Tests: 10ml（4倍浓缩液） 
100Tests: 20ml（4倍浓缩液）
稀释后溶液中各组分浓度：10mM Hepes/NaOH, pH7.4,140mM NaCl, 2.5mM CaCl2 

2.碘化丙锭溶液（ Propidium Iodide, PI）
体积： 
50Tests:0.5ml 
100Tests:1.0ml
浓度：20ug/ml 

3.重组人 Annexin V/Alexa Fluor647, (rh AnnexinV/Alexa Fluor647)
来源：大肠杆菌（E.coli）
分子量：35.8KDa
样品量：
50Tests: 0.25ml，可用于50次实验
100Tests: 0.5ml，可用于100次实验

保存方法：于50mMTris, 100mM NaCl, 1%BSA, 0.02%NaN3,pH7.4溶液中保存。
纯度： SDS-PAGE及反相 HPLC表明纯度大于 98%
生物活性： AnnexinV可结合于磷酯酰丝氨酸并表现出抗磷酯酶活性。

操作步骤： 
1.细胞样品的准备： 
a)对于贴壁细胞：小心收集细胞培养液到一离心管内备用。用不含EDTA的胰酶消化细胞，至细胞可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时，加入前面收集的细胞培养液，吹打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞。再次收集到离心管内。1000rpm左右离心5min，沉淀细胞。对于特定的细胞，如果细胞无法完全离心至离心管底，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。小心吸除上清，可以残留约 50µl左右的培养液，以避免吸走细胞。加入约1ml 4℃预冷的PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清。 
b)对于悬浮细胞： 1000rpm左右离心 5min，沉淀细胞。对于特定的细胞，如果细胞无法完全离心至离心管底，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。小心吸除上清，可以残留约 50µl左右的培养液，以避免吸走细胞。加入约 1ml4℃预冷的 PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清。 
2.用去离子水按1:3稀释结合缓冲液(4ml 4x结合缓冲液+12ml去离子水 )； 
3.用1x结合缓冲液重新悬浮细胞，调节其浓度为 1-5×106/ml； 
4.取100µl的细胞悬液于5ml流式管中，加入 5µlAnnexin V/Alexa Fluor 647混匀后于室温避光孵育 5分钟； 
5.加入10µl 20ug/ml的碘化丙锭溶液(PI)，并加400µl PBS，立刻进行流式检测。

实验设计： 
1)未转染细胞
空白管：阴性对照组细胞，不加Annexin V/Alexa Fluor 647，碘化丙锭溶液 (PI)。用于调节电压。
检测管：处理的细胞，加 Annexin V/Alexa Fluor 647，碘化丙锭溶液 (PI)。用空白管和单阳管调节好电压补偿后，获得所需要的流式数据。
注：无需用单染管 Annexin V/Alexa Fluor 647调补偿。 

2)转染GFP细胞
未转染空白管：未转染细胞，不加Annexin V/Alexa Fluor 647，碘化丙锭溶液 (PI)。用于调电压。
转染GFP空白管：转染GFP对照组细胞，不加Annexin V/Alexa Fluor 647，碘化丙锭溶液 (PI)。用于调补偿。
检测管：处理的细胞，加Annexin V/Alexa Fluor 647，碘化丙锭溶液 (PI)。调节好电压补偿后，获得所需要的流式数据。

常见问题： 
1、Annexin V/PI凋亡检测的试剂盒能否检测人以外其他动物的细胞凋亡情况？
可以。因为 Annexin V是与磷脂酰丝氨酸 (PS)亲和，而 PS在不同种属间没差异。在正常细胞中， PS只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期， PS由脂膜内侧翻向外侧。 

2、贴壁细胞做凋亡用胰酶消化下来对细胞膜损伤？

低浓度胰酶消化，轻柔吹打贴壁细胞 2～3次，离心机 4℃1000rpm 5min离心，处理得当的话，胰酶造成损伤可以控制在5%以内，有对照组的情况下对实验结果不会造成明显影响。 

3、贴壁细胞可以先染 PI然后再消化下来吗？这样是否可以减小由于消化液造成的细胞膜破损而染上的 PI 的误差？

先加 PI不仅染色是否每组都均匀充分很难判断，而且 PI本身对细胞也是有毒性的，对实验结果影响会比胰酶大，不建议这样做。 

4、为什么只能用不含 EDTA的胰酶消化贴壁细胞，用含 EDTA的胰酶消化细胞对结果有什么影响？

因为 Annexin V是 Ca依赖的蛋白，所以不能加入 EDTA，防止 EDTA螯合了 Ca离子从而影响 Annexin V，进而影响结果。 

5、有些厂家说明书 Annexin V和 PI一起加？为什么你们先加 Annexin V后加 PI？
用流式检测凋亡时， PI受时间的影响很大，因标记了 PI后会加大细胞毒性，随着时间延长会导致 PI的染色增加，特别是检测早期凋亡时，如果时间延长除了会导致在流式细胞仪上的细胞分群差距加大外，误差会明显加大。一般 PI加上后立刻上机，然后在一个小时内检测完成。两种方法都可以，但是按照我们操作步骤造成的误差会更小。 
6、你们哪种凋亡检测试剂盒能用于转染 GFP细胞的凋亡检测？ 
1708 Annexin V-PE/7AAD凋亡检测试剂盒 
1706 Annexin V-Alexa Fluor 647/PI Kit凋亡检测试剂盒

实验参考图：