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Annexin V-eGFP/PI Kit流式检测试剂盒

Annexin V-eGFP/PI Kit流式检测试剂盒

产品编号:17107

产品规格:50T/100T

产品价格:1270/1820

包装:

储存条件:C

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Annexin V-eGFP/PI Kit流式检测试剂盒

产品介绍:

细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面,这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜内转移到细胞膜外,使PS暴露在细胞膜外表面。PS是一种带负电荷的磷脂,正常主要存在于细胞膜的内面,在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使PS暴露在细胞膜外。AnnexinV具有易于结合到磷脂类如PS的特性,对PS有高度的亲和性。因此,该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的PS。PS转移到细胞膜外不是凋亡所独特的,也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的,而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。因此,可以采用AnnexinV与PI双染的方法,通过流式检测细胞早期凋亡。

储存条件:
2-8℃避光保存,勿冰冻。

注意事项:
本试剂盒需使用流式细胞仪进行检测。
此产品仅供研究,不用于临床诊断。

试剂盒组份: 
1.结合缓冲液 4x(Binding Buffer 4x)
体积:
50Tests: 10ml(4倍浓缩液) 
100Tests: 20ml(4倍浓缩液)
稀释后溶液中各组分浓度:10mM Hepes/NaOH, pH 7.4,140mM NaCl, 2.5mM CaCl2 

2.碘化丙锭溶液(Propidium Iodide, PI)
体积:
50Tests: 0.5ml 
100Tests: 1.0ml
浓度: 20ug/ml 

3.重组人 Annexin V/eGFP, (rh Annexin V/eGFP)
来源:大肠杆菌( E.coli)
分子量: 35.8KDa
样品量:
50Tests: 0.25ml,可用于 50次实验
100Tests: 0.5ml,可用于 100次实验

保存方法:于 50mMTris, 100mM NaCl, 1%BSA, 0.02%NaN3,pH7.4溶液中保存。
纯度: SDS-PAGE及反相HPLC表明纯度大于98%
生物活性: AnnexinV可结合于磷酯酰丝氨酸并表现出抗磷酯酶活性。

操作步骤: 
1.细胞样品的准备: 
a)对于贴壁细胞:小心收集细胞培养液到一离心管内备用。用不含EDTA的胰酶消化细胞,至细胞可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时,加入前面收集的细胞培养液,吹打下所有的贴壁细胞,并轻轻吹散细胞。再次收集到离心管内。1000rpm左右离心5min,沉淀细胞。对于特定的细胞,如果细胞无法完全离心至离心管底,可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。小心吸除上清,可以残留约50µl左右的培养液,以避免吸走细胞。加入约1ml 4℃预冷的PBS,重悬细胞,再次离心沉淀细胞,小心吸除上清。 
b)对于悬浮细胞:1000rpm左右离心5min,沉淀细胞。对于特定的细胞,如果细胞无法完全离心至离心管底,可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。小心吸除上清,可以残留约50µl左右的培养液,以避免吸走细胞。加入约1ml4℃预冷的PBS,重悬细胞,再次离心沉淀细胞,小心吸除上清。 
2.用去离子水按1:3稀释结合缓冲液(4ml 4x结合缓冲液+12ml去离子水); 
3.用1x结合缓冲液重新悬浮细胞,调节其浓度为1-5×106/ml; 
4.取100µl的细胞悬液于5ml流式管中,加入5µlAnnexin V/eGFP混匀后于室温避光孵育 5分钟; 
5.加入10µl 20ug/ml的碘化丙锭溶液(PI),并加400µl PBS,立刻进行流式检测。

实验设计:
空白管:阴性对照组细胞,不加Annexin V/eGFP,碘化丙锭溶液(PI)。用于调节电压。
单染管:阳性对照组细胞,只加 Annexin V/eGFP。用于调节补偿。
检测管:处理的细胞,加Annexin V/eGFP,碘化丙锭溶液(PI)。用空白管和单染管调节好电压补偿后,获得所需要的流式数据。

常见问题: 
1、Annexin V/ PI凋亡检测的试剂盒能否检测人以外其他动物的细胞凋亡情况?
可以。因为 Annexin V是与磷脂酰丝氨酸 (PS)亲和,而 PS在不同种属间没差异。在正常细胞中, PS只分布在细胞膜脂质双层的内侧,而在细胞凋亡早期, PS由脂膜内侧翻向外侧。 

2、贴壁细胞做凋亡用胰酶消化下来对细胞膜损伤?

低浓度胰酶消化,轻柔吹打贴壁细胞2~3次,离心机4℃1000rpm 5min离心,处理得当的话,胰酶造成损伤可以控制在5%以内,有对照组的情况下对实验结果不会造成明显影响。 

3、贴壁细胞可以先染 PI然后再消化下来吗?这样是否可以减小由于消化液造成的细胞膜破损而染上的 PI的误差?

先加 PI 不仅染色是否每组都均匀充分很难判断,而且 PI 本身对细胞也是有毒性的,对实验结果影响会比胰酶大,不建议这样做。 

4、为什么只能用不含 EDTA的胰酶消化贴壁细胞,用含 EDTA的胰酶消化细胞对结果有什么影响?

因为 Annexin V是 Ca 依赖的蛋白,所以不能加入 EDTA,防止 EDTA螯合了 Ca 离子从而影响 Annexin V,进而影响结果。 

5、有些厂家说明书Annexin V和 PI一起加?为什么你们先加 Annexin V后加 PI ?

用流式检测凋亡时, PI受时间的影响很大,因标记了 PI后会加大细胞毒性,随着时间延长会导致 PI的染色增加,特别是检测早期凋亡时,如果时间延长除了会导致在流式细胞仪上的细胞分群差距加大外,误差会明显加大。一般 PI加上后立刻上机,然后在一个小时内检测完成。两种方法都可以,但是按照我们操作步骤造成的误差会更小。 

6、你们哪种凋亡检测试剂盒能用于转染 GFP细胞的凋亡检测? 
1708 Annexin V-PE/7AAD凋亡检测试剂盒 
1706 Annexin V-Alexa Fluor 647/PI Kit凋亡检测试剂盒

实验参考图:

Jurkat细胞用紫外诱导凋亡后用Annexin V-eGFP/PI双染流式分析图谱

相关凋亡检测试剂盒:

17104 Annexin V-FITC/PI Kit 50/100次 1050/1840
17105 Annexin V-Alexa Fluor488/PI Kit 50/100次 1050/1840
17106 Annexin V-Alexa Fluor647/PI Kit 50/100次 1050/1840
17107 Annexin V-EGFP/PI Kit 50/100次 1050/1840
17108 Annexin V-PE/7-AAD Kit 50/100次 1680/2680