Annexin V-PE/7-AAD Kit凋亡检测试剂盒
包装规格：
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17108-50
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Annexin V-PE/7-AAD Kit凋亡检测试剂盒
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50T
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1060元
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17108-100
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Annexin V-PE/7-AAD Kit凋亡检测试剂盒
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100T
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1820元
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产品介绍:
细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜内转移到细胞膜外，使PS暴露在细胞膜外表面。PS是一种带负电荷的磷脂，正常主要存在于细胞膜的内面，在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使PS暴露在细胞膜外。AnnexinV具有易于结合到磷脂类如PS的特性，对PS有高度的亲和性。因此，该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的PS。PS转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。因此，可以采用 AnnexinV与7AAD双染的方法，通过流式检测细胞早期凋亡。
储存条件:
2-8℃避光保存,勿冰冻。
注意事项:
本试剂盒需使用流式细胞仪进行检测。
此产品仅供研究，不用于临床诊断。
试剂盒组份：
1.结合缓冲液 4x(Binding Buffer 4x)
体积：
50Tests: 10ml（4倍浓缩液）
100Tests: 20ml（4倍浓缩液）
稀释后溶液中各组分浓度：10mM Hepes/NaOH, pH7.4,140mM NaCl, 2.5mM CaCl2
2.7-AAD Viability Staining Solution
体积：
50Tests: 0.5ml
100Tests: 1.0ml
浓度： 20ug/ml
3.重组人Annexin V/PE, (rh Annexin V/PE)
来源：大肠杆菌（ E.coli）
分子量： 35.8KDa
样品量：
50Tests: 0.25ml，可用于50次实验
100Tests: 0.5ml，可用于100次实验
保存方法：于50mMTris, 100mM NaCl, 1%BSA, 0.02%NaN3,pH7.4溶液中保存。
纯度：SDS-PAGE及反相 HPLC表明纯度大于98%
生物活性：AnnexinV可结合于磷酯酰丝氨酸并表现出抗磷酯酶活性。
操作步骤：
1.细胞样品的准备：
a)对于贴壁细胞：小心收集细胞培养液到一离心管内备用。用不含EDTA的胰酶消化细胞，至细胞可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时，加入前面收集的细胞培养液，吹打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞。再次收集到离心管内。 1000rpm左右离心5min，沉淀细胞。对于特定的细胞，如果细胞无法完全离心至离心管底，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。小心吸除上清，可以残留约50µl左右的培养液，以避免吸走细胞。加入约1ml 4℃预冷的PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清。
b)对于悬浮细胞：1000rpm左右离心5min，沉淀细胞。对于特定的细胞，如果细胞无法完全离心至离心管底，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。小心吸除上清，可以残留约50µl左右的培养液，以避免吸走细胞。加入约1ml4℃预冷的 PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清。
2.用去离子水按1:3稀释结合缓冲液 (4ml 4x结合缓冲液+12ml去离子水 )；
3.用1x结合缓冲液重新悬浮细胞，调节其浓度为1-5×106/ml；
4.取100µl的细胞悬液于5ml流式管中，加入5µl Annexin V/PE混匀后于室温避光孵育5分钟；
5.加入10µl 20ug/ml的7AAD，并加400µl PBS，立刻进行流式检测。
实验设计：
1)未转染细胞
空白管：阴性对照组细胞，不加Annexin V/PE，7AAD。用于调节。
电压单染管(两管)：有明显凋亡的细胞，只加Annexin V/PE或只加7AAD。用于调节补偿。
检测管：处理的细胞，加Annexin V/PE，7AAD。用空白管和单阳管调节好电压补偿后，获得所需要的流式数据。
2)转染 GFP细胞
未转染空白管：未转染细胞，不加Annexin V/PE，7AAD。用于调电压。
未转染单染管：未转染且有明显凋亡的细胞，只加Annexin V/PE或只加7AAD。用于调节补偿。
转染GFP空白管：转染GFP对照组细胞，不加Annexin V/PE，7AAD。用于调补偿。
检测管：处理的细胞，加Annexin V/PE，7AAD。调节好电压补偿后，获得所需要的流式数据。
常见问题：
1、Annexin V/7AAD凋亡检测的试剂盒能否检测人以外其他动物的细胞凋亡情况？
可以。因为 Annexin V是与磷脂酰丝氨酸(PS)亲和，而 PS在不同种属间没差异。在正常细胞中， PS只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期， PS由脂膜内侧翻向外侧。
2、贴壁细胞做凋亡用胰酶消化下来对细胞膜损伤？
低浓度胰酶消化，轻柔吹打贴壁细胞 2～3次，离心机 4℃1000rpm 5min离心，处理得当的话，胰酶造成损伤可以控制在 5%以内，有对照组的情况下对实验结果不会造成明显影响。
3、贴壁细胞可以先染 PI然后再消化下来吗？这样是否可以减小由于消化液造成的细胞膜破损而染上的 PI的误差？
先加 PI不仅染色是否每组都均匀充分很难判断，而且 PI本身对细胞也是有毒性的，对实验结果影响会比胰酶大，不建议这样做。
4、为什么只能用不含 EDTA的胰酶消化贴壁细胞，用含 EDTA的胰酶消化细胞对结果有什么影响？
因为Annexin V是Ca依赖的蛋白，所以不能加入EDTA，防止EDTA螯合了Ca离子从而影响Annexin V，进而影响结果。
5、你们哪种凋亡检测试剂盒能用于转染GFP细胞的凋亡检测？
1708 Annexin V-PE/7AAD Kit凋亡检测试剂盒
1706 AnnexinV-Alexa Fluor 647/PI Kit凋亡检测试剂盒
实验参考图：
