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高纯度质粒小量快速提取试剂盒(离心柱型)

本试剂盒采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞,离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA,再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除,最后低盐、高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。

产品编号:2201

产品规格:100次/200次

产品价格:312/600

包装:

储存条件:4℃

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高纯度质粒小量快速提取试剂盒(离心柱型)


包装规格:

2201A 高纯度质粒小量快速提取试剂盒(离心柱型) 50次 200元
2201B 高纯度质粒小量快速提取试剂盒(离心柱型) 100次 312元
2201C 高纯度质粒小量快速提取试剂盒(离心柱型) 200次 600元


一.产品介绍:
   本试剂盒采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞,离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA,再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除,最后低盐、高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。

二.产品特点:
1.离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜,柱与柱之间吸附量差异极小,可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
2.独有的去蛋白液配方,可以高效去除残留的核酸酶,即使是核酸酶含量丰富的菌株如JM系列、HB101也可以轻松去除。有效防止了质粒被核酸酶降解。
3.快速、方便,不需要使用有毒的苯酚、氯仿等试剂,也不需要乙醇沉淀。获得的质粒产量高、纯度好, 可以直接用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序等各种分子生物学实验。

三.储存条件:
1.第一次使用时,将试剂盒所带的全部RNase A加入溶液P1后(终浓度100ug/ml)置于2-8℃保存。如果溶液P1中RNase A失活,提取的质粒可能会有微量RNA残留,在溶液P1中补加RNase A即可。
2.环境温度低时溶液P2中SDS可能会析出浑浊或者沉淀,可在37℃水浴加热几分钟,即可恢复澄清,不要剧烈摇晃,以免形成过量的泡沫。
3.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化,各溶液使用后应及时盖紧盖子。

四.注意事项:
1.所有的离心步骤均在室温完成,使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机,如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。
2.提取质粒的量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。一般高拷贝质粒,建议接种单菌落于1.5-4.5 ml加合适抗生素的LB培养基, 过夜培养14-16个小时,可提取出多达20µg的纯净质粒。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb的大质粒,应适当加大菌体使用量,使用5-10 ml过夜培养物,同时按比例增加P1、P2、P3的用量,其它步骤相同。
3.得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。OD260值为1相当于大约50μg/ml DNA。电泳可能为单一条带,也可能为2条或者多条DNA条带,这主要是不同程度的超螺旋构象质粒泳动位置不一造成,与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。本公司产品正常操作情况下基本超螺旋可以超过90%。
4.质粒DNA确切分子大小, 必须酶切线性化后,对比DNA分子量Marker才可以知道。处于环状或者超螺旋状态的的质粒,泳动位置不确定,无法通过电泳知道其确切大小。
5.洗脱液EB不含有螯合剂EDTA,不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱,但应该确保pH大于7.5,pH过低影响洗脱效率。用水洗脱质粒应该保存在-20℃。质粒DNA如果需要长期保存,可以用TE缓冲液洗脱(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA,pH 8.0),但是EDTA可能影响下游酶切反应,使用时可以适当稀释。

关于平衡液的使用
1.介绍:核酸吸附硅胶膜柱子长期放置过程中会同空气中的电荷/尘埃发生反应而影响其核酸的结合能力。硅胶柱经平衡液预处理后可大大减少柱子中硅胶膜的憎水基团,提高核酸的结合能力。从而提高硅胶柱子回收效率或者产量。平衡液是强碱性溶液,若不小心碰到,请用大量自来水清洗。用完后需盖紧瓶盖,以免接触空气。室温保存。在保存过程中可能有沉淀生成,请加热至37℃使沉淀完全消失。
2.使用方法:取一个新的硅胶膜吸附柱子装在收集管中,吸取100μl的平衡液至柱子中。13000 rpm离心1分钟,倒掉收集管中废液,将吸附柱子重新放回收集管。此时平衡液预处理柱子完毕。接后续的操作步骤。

五.操作步骤:(实验前请先阅读注意事项)
 提示:
  第一次使用前请先在漂洗液WB和去蛋白液PE瓶中加入指定量无水乙醇,充分混匀,加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇,以免多次加入!
  将RNase A全部加入溶液P1中,混匀,每次使用后置于2-8℃保存。


1.取1.5-4.5 ml过夜培养的菌液,12,000rpm离心30秒,尽可能的倒干上清,收集菌体。
收集超过1.5 ml菌液, 可以离心弃上清后,在同一个1.5ml管内加入更多的菌液,重复步骤1,直到收集到足够的菌体。


2.用250μl溶液P1重悬菌体沉淀,涡旋振荡至彻底悬浮。  
如果有未彻底混匀的菌块,会影响裂解,导致提取量和纯度偏低。


3.加250μl的溶液P2,温和地上下翻转6 -8次使菌体充分裂解,室温放置4分钟。
温和地混合,不要剧烈震荡,以免基因组DNA剪切断裂!所用时间不应超过5分钟!以免质粒受到破坏。此时菌液应变得清亮粘稠,如果菌体少,很快清亮粘稠后就可以做下一步,不是一定要准确的5分钟。


4.加350μl溶液P3,立即温和地上下翻转6 -8次,充分混匀时会出现白色絮状沉淀。13,000rpm离心10分钟,小心取上清。
加入溶液P3后应该立即混匀,以免产生SDS的局部沉淀。


平衡液预处理吸附柱:
使用平衡液预处理硅胶膜吸附柱为必做步骤,具体方法参见前文“关于平衡液的使用”
5.将上一步所得上清加入吸附柱AC中(吸附柱放入收集管中), 12,000rpm离心30-60秒,倒掉收集管中的废液。


6.可选步骤:加入500μl去蛋白液PE,12,000rpm 离心30-60秒,弃废液。
此步骤为了去除痕量核酸酶等杂质,如所用菌株为JM系列、HB101等endA菌株或野生型菌株,核酸酶含量丰富,应加此步骤;如所用菌株为XL-1 Blue、Top10和DH5α等缺陷型菌株,核酸酶含量低,则可略过此步骤。


7.加入600μl漂洗液WB(请先检查是否已加入无水乙醇!),12,000rpm 离心30秒,弃掉废液。


8.加入600μl漂洗液WB,12,000rpm 离心30秒,弃掉废液。


9.将吸附柱AC放回空收集管中,13,000rpm离心2分钟,尽量除去漂洗液, 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。


10.取出吸附柱AC,放入一个干净的离心管中,在吸附膜的中间部位加50-100μl洗脱缓冲液EB(洗脱缓冲液事先在 65-70℃水浴中加热效果更好),室温放置2分钟,12,000rpm 离心1分钟。如果需要较多量质粒,可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中,离心1分钟。


洗脱体积越大,洗脱效率越高。如果需要质粒浓度较高,可以适当减少洗脱体积, 但是最小体积不应少于30μl,体积过小降低质粒洗脱效率,减少质粒产量。


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