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细菌基因组DNA快速提取试剂盒(离心柱型)

独特的结合液/蛋白酶K迅速裂解细胞和灭活细胞内核酸酶,然后基因组DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜, 再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤,抑制物去除液和漂洗液将细胞代谢物,蛋白等杂质去除, 最后低盐的洗脱缓冲液将纯净基因组DNA从硅基质膜上洗脱。

产品编号:2512

产品规格:50次/100次/200次

产品价格:504/864/1680

包装:

储存条件:4℃

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细菌基因组DNA快速提取试剂盒(离心柱型)


一.产品介绍:
独特的结合液/蛋白酶K迅速裂解细胞和灭活细胞内核酸酶,然后基因组DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜, 再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤,抑制物去除液和漂洗液将细胞代谢物,蛋白等杂质去除, 最后低盐的洗脱缓冲液将纯净基因组DNA从硅基质膜上洗脱。

二.产品特点:
1.离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜,柱与柱之间吸附量差异极小,可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
2.不需要使用有毒的苯酚等试剂,也不需要乙醇沉淀等步骤。
3.快速,简捷,单个样品操作一般可在30分钟内完成。
4.多次柱漂洗确保高纯度,OD260/OD280典型的比值达1.7~1.9,长度可达30kb -50kb,可直接用于PCR,Southern-blot和各种酶切反应。

三.适用范围:
   适用于快速提取各种细菌基因组DNA。

四.储存条件:
1.结合液CB或者抑制物去除液IR低温时可能出现析出和沉淀,可以在37℃水浴几分钟帮助重新溶解,恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。
2.为避免降低活性,方便运输,提供蛋白酶K为冻干粉状,收到后,可短暂离心后,加入1毫升灭菌水溶解,因为反复冻融可能会降低酶活性,因此溶解后立即按照每次使用量(20微升)分装冻存,-20℃保存。
3.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化,各溶液使用后应及时盖紧盖子。

五.注意事项:
1.所有的离心步骤均在室温完成,使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机,如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。
2.开始实验前根据需要将水浴预热到37℃或者70℃备用。
3.需要自备异丙醇。
4.需自备0.5M EDTA、Triton X-100和Lysozyme(溶菌酶)(用于革兰氏阳性菌)。
5.结合液CB 和抑制物去除液IR中含有刺激性化合物,操作时要戴乳胶手套,避免沾染皮肤,眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时,用大量清水或者生理盐水冲洗。
  洗脱液EB不含有螯合剂EDTA,不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱,但应该确保批pH大于7.5, pH过低影响洗脱效率。用水洗脱DNA应该保存在-20℃。DNA如果需要长期保存,可以用TE缓冲液洗脱(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA,pH 8.0),但是EDTA可能影响下游酶切反应,使用时可以适当稀释。

六.操作步骤:(实验前请先阅读注意事项)
   提示:第一次使用前请先在漂洗液WB中加入指定量无水乙醇,充分混匀,加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇,以免多次加入!


1.取0.5-2毫升培养菌液(最多不超过2×109个细胞),10,000rpm,离心30秒,尽可能的吸弃上清,收集菌体。
起始处理量可以根据细菌密度、细胞种类、预期产量进行调整,但是离心吸附柱最大吸附能力是20μg基因组DNA,如果菌体过量超过最大吸附能力,反而会严重降低产量。


2.加入200μl缓冲液RB重悬,10,000rpm离心30秒,弃上清。将细胞振荡或者吹打充分重悬于180μl缓冲液RB中。
注意:对于较难破壁的革兰氏阳性菌,可略过第2步骤,加入溶菌酶进行破壁处理,具体方法为:加入180 μl缓冲液(20 mM Tris, pH 8.0;2 mM Na2-EDTA;1.2% Triton X-100;临用前加入终浓度为20 mg/ml的溶菌酶(溶菌酶必须用溶菌酶干粉溶解在缓冲液中进行配制,否则会导致溶菌酶无活性)),37 ℃处理30 min以上。


3.加入20μl蛋白酶K (20mg/ml)溶液,充分混匀,再加入200μl 结合液CB,立刻涡旋振荡充分混匀,在70℃放置10分钟。
可选做步骤: 如果RNA残留较多,需要去除RNA,可以在加入200μl 结合液CB 前加4μl RNase A(100mg/ml)溶液,振荡混匀,室温放置5-10分钟。


4.冷却后加入100μl 异丙醇,立刻涡旋振荡充分混匀,此时可能会出现絮状沉淀。
上述步骤中立刻涡旋或者吹打充分混匀非常重要,混匀不充分严重降低产量,必要时如样品粘稠不易混匀时可以涡旋振荡15秒混匀。


5.将上一步混合物(包括可能有的沉淀)加入一个吸附柱AC中,(吸附柱放入收集管中)13,000 rpm离心30-60秒,倒掉收集管中的废液。


6.加入500μl抑制物去除液IR,12,000 rpm 离心30秒,弃废液。


7.加入600μl漂洗液WB(请先检查是否已加入无水乙醇!),12,000 rpm 离心30秒,弃掉废液。


8.加入600μl漂洗液WB,12,000 rpm 离心30秒,弃掉废液。


9.将吸附柱AC放回空收集管中,13,000 rpm离心2分钟,尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。


10.取出吸附柱AC,放入一个干净的离心管中,在吸附膜的中间部位加100μl洗脱缓冲液EB(洗脱缓冲液事先在 65-70℃水浴中预热效果更好), 室温放置3-5分钟,12,000 rpm 离心1分钟。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中,室温放置2分钟,12,000 rpm离心1分钟。
洗脱体积越大,洗脱效率越高,如果需要DNA浓度较高,可以适当减少洗脱体积, 但是最小体积不应少于30μl,体积过小降低DNA洗脱效率,减少DNA产量。


11.DNA可以存放在2-8℃,如果要长时间存放,可以放置在-20℃。