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细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱法)

Bacteria DNA Extraction Kit(Column)

包装规格：

一.产品介绍：
独特的结合液/蛋白酶K迅速裂解细胞和灭活细胞内核酸酶，然后基因组DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜， 再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤，抑制物去除液和漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质去除， 最后低盐的洗脱缓冲液将纯净基因组DNA从硅基质膜上洗脱。

二.产品特点：
1.离心吸附柱内硅基质膜采用进口公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
2.不需要使用有毒的苯酚等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。
3.快速，简捷，单个样品操作一般可在30分钟内完成。
4.多次柱漂洗确保高纯度，OD260/OD280典型的比值达1.7～1.9，长度可达30kb -50kb，可直接用于PCR，Southern-blot和各种酶切反应。

三.适用范围：
   适用于快速提取各种细菌基因组DNA。

四.储存条件：
1.结合液CB或者抑制物去除液IR低温时可能出现析出和沉淀，可以在37℃水浴几分钟帮助重新溶解，恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。
2.为避免降低活性，方便运输，提供蛋白酶K为冻干粉状，收到后，可短暂离心后，加入1毫升灭菌水溶解，因为反复冻融可能会降低酶活性，因此溶解后立即按照每次使用量(20微升)分装冻存，－20℃保存。
3.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

五.注意事项：
1.所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。
2.开始实验前根据需要将水浴预热到37℃或者70℃备用。
3.需要自备异丙醇。
4.需自备0.5M EDTA、Triton X-100和Lysozyme（溶菌酶）(用于革兰氏阳性菌)。
5.结合液CB 和抑制物去除液IR中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，用大量清水或者生理盐水冲洗。
  洗脱液EB不含有螯合剂EDTA，不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱，但应该确保批pH大于7.5， pH过低影响洗脱效率。用水洗脱DNA应该保存在－20℃。DNA如果需要长期保存，可以用TE缓冲液洗脱（10mM Tris-HCl， 1mM EDTA，pH 8.0），但是EDTA可能影响下游酶切反应，使用时可以适当稀释。

六.操作步骤：（实验前请先阅读注意事项）
   提示：第一次使用前请先在漂洗液WB中加入指定量无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!

1.取0.5-2毫升培养菌液（最多不超过2×109个细胞），10,000rpm，离心30秒，尽可能的吸弃上清，收集菌体。
起始处理量可以根据细菌密度、细胞种类、预期产量进行调整，但是离心吸附柱最大吸附能力是20μg基因组DNA，如果菌体过量超过最大吸附能力，反而会严重降低产量。

2.加入200μl缓冲液RB重悬，10,000rpm离心30秒，弃上清。将细胞振荡或者吹打充分重悬于180μl缓冲液RB中。
注意：对于较难破壁的革兰氏阳性菌，可略过第2步骤，加入溶菌酶进行破壁处理，具体方法为：加入180 μl缓冲液(20 mM Tris, pH 8.0；2 mM Na2-EDTA；1.2% Triton X-100；临用前加入终浓度为20 mg/ml的溶菌酶(溶菌酶必须用溶菌酶干粉溶解在缓冲液中进行配制，否则会导致溶菌酶无活性))，37 ℃处理30 min以上。

3.加入20μl蛋白酶K (20mg/ml)溶液，充分混匀，再加入200μl 结合液CB，立刻涡旋振荡充分混匀，在70℃放置10分钟。
可选做步骤: 如果RNA残留较多，需要去除RNA，可以在加入200μl 结合液CB 前加4μl RNase A(100mg/ml)溶液，振荡混匀，室温放置5-10分钟。

4.冷却后加入100μl 异丙醇，立刻涡旋振荡充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。
上述步骤中立刻涡旋或者吹打充分混匀非常重要，混匀不充分严重降低产量，必要时如样品粘稠不易混匀时可以涡旋振荡15秒混匀。

5.将上一步混合物（包括可能有的沉淀）加入一个吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13,000 rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液。

6.加入500μl抑制物去除液IR，12,000 rpm 离心30秒，弃废液。

7.加入600μl漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000 rpm 离心30秒，弃掉废液。

8.加入600μl漂洗液WB，12,000 rpm 离心30秒，弃掉废液。

9.将吸附柱AC放回空收集管中，13,000 rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

10.取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μl洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在 65-70℃水浴中预热效果更好）， 室温放置3-5分钟，12,000 rpm 离心1分钟。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2分钟，12,000 rpm离心1分钟。
洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要DNA浓度较高，可以适当减少洗脱体积， 但是最小体积不应少于30μl，体积过小降低DNA洗脱效率，减少DNA产量。

11.DNA可以存放在2-8℃,如果要长时间存放，可以放置在－20℃。