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凝固全血基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)(0.1-1mL)

Coagulated Blood DNA Extraction Kit(Column,0.1-1mL)

包装规格：

一.  产品介绍：

本试剂盒可以高效提取凝固血块中的基因组DNA，独特的结合液/蛋白酶K迅速裂解细胞和灭活细胞内核酸酶，然后基因组DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜， 再通过一系列快速的漂洗－离心的， 抑制物去除液和漂洗液将细胞代谢物、蛋白等杂质去除，最后低盐的洗脱缓冲液将纯净基因组DNA从硅基质膜上洗脱。

二.  产品特点：

1.不需要使用有毒的苯酚等试剂，也不需要乙醇沉淀等。

2.快速，简捷，单个样品操作一般可在30分钟内完成。

3.多次柱漂洗确保高纯度，典型的产量1ml全血可提取出15-20µg基因组DNA，OD260/OD280典型的比值达1.7～1.9，长度可达30 kb -50kb，可直接用于PCR、Southern-blot和各种酶切反应。

4.典型的产量200µl全血可提取出3-6µg 基因组DNA。

三.  适用范围：

适用于快速提取提取0.1-1ml凝固血块中的基因组DNA。

四.  储存条件：

1.裂解液TL、结合液CB、或者抑制物去除液IR低温时可能出现析出和沉淀，可以在37℃水浴几分钟帮助重新溶解，恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。

2.为避免降低活性，方便运输，提供蛋白酶K为冻干粉状，收到后，可短暂离心后，加入1毫升灭菌水溶解。因为反复冻融可能会降低酶活性，因此溶解后立即按照每次使用量(20微升)分装冻存，－20℃保存。

3.避免试剂长时间暴露于空气中发生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

五.  注意事项：

1.所有的离心均在室温完成，使用转速可以达到13,000 rpm的传统台式离心机，如Eppendorf5415C或者类似离心机。

2.需要自备1ml不带针头的一次性输液器和异丙醇。

3.不同样品尤其疾病样品中白细胞数量差异可能非常大，因此产量的个体差异也可能非常大。

4.开始实验前将需要的水浴先预热到70℃备用。

5.为了最佳效果，最好使用新鲜血液标本或者4℃存放少于3天的标本，不要使用反复冻融超过3次的标本，否则会严重降低产量。

关于平衡液的使用:

1.介绍：核酸吸附硅胶膜柱子长期放置过程中会同空气中的电荷/尘埃发生反应而影响其核酸的结合能力。硅胶柱经平衡液预处理后可大大减少柱子中硅胶膜的憎水基团，提高核酸的结合能力。从而提高硅胶柱子回收效率或者产量。平衡液是强碱性溶液，若不小心碰到，请用大量自来水清洗。用完后需盖紧瓶盖，以免接触空气。室温保存。在保存过程中可能有沉淀生成，请加热至37℃使沉淀完全消失。

2.使用方法：（临用前才预处理）取一个新的硅胶膜吸附柱子装在收集管中，吸取100μl的平衡液至柱子中。13000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中废液，将吸附柱子重新放回收集管。此时平衡液预处理柱子完毕。接后续的操作步骤。

六.  操作步骤：（实验前请先阅读注意事项）

提示：第一次使用前请先在漂洗液WB中加入指定量无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!

平衡液预处理吸附柱备用：

使用平衡液预处理硅胶膜吸附柱为必做步骤，具体方法参见前文“关于平衡液的使用”

1.在0.1-1ml凝固血块中，用解剖刀取大约20-50mg凝固血块切成小碎块后转入1.5ml离心管中，用手持式组织研磨仪研磨匀浆（货号：GE002-18K），或者在液氮中研磨组织成细粉后，之后加900ul 1x红细胞裂解液，涡旋震荡混匀，室温放置10分钟（期间应该颠倒轻弹混匀数次，帮助裂解红细胞）。

2.12,000 rpm离心1min，吸弃红色上清，留下完整的管底白细胞团和大约10μl的残留上清，再用手持组织研磨仪均质5-10秒，再加900ul 1x红细胞裂解液，涡旋震荡混匀，室温放置5分钟（期间应该颠倒轻弹混匀数次，帮助裂解红细胞）。

3.12,000 rpm离心1min，吸弃红色上清，留下完整的管底白细胞团和大约10μl的残留上清。

4.200μl组织裂解液TL的1.5ml离心管中，涡旋振荡重悬白细胞团。

5.加入30μl的蛋白酶K溶液(20mg/ml)，立刻涡旋振荡充分混匀。

6.将裂解物放置在55℃水浴3小时或者直到组织消化完全，期间轻柔的振荡几次帮助裂解。

可选做步骤:如果RNA残留较多，需要去除RNA，可在完成步骤6后加20μl RNase A(25mg/ml)溶液，振荡混匀，室温放置5-10分钟。

7.冷却后如果还有未溶解的凝血血块，用1ml不带针头的一次性输液器反复抽吸10次，再加入200μl 结合液CB，立刻涡旋振荡充分混匀，70℃放置10分钟。

8.冷却后加100μl 异丙醇，立刻涡旋振荡充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。

9.用1ml的枪头吸取混合物，将混合物加入一个吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13,000rpm离心60秒，倒掉收集管中的废液。

上述步骤中凝固血块充分溶解，以及立刻涡旋或者吹打充分混匀非常重要，混匀不充分严重降低产量，必要时如样品粘稠不易混匀时可以涡旋振荡15秒混匀。

10.加入500μl抑制物去除液IR，12,000rpm 离心30秒，弃废液。

11.加入600μl漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000rpm 离心30秒，弃掉废液。

12.加入600μl漂洗液WB，12,000rpm 离心30秒，弃掉废液。

13.将吸附柱AC放回空收集管中，13,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液， 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

14.取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μl洗脱缓冲液EB （洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴中预热）， 室温放置3-5分钟，12,000rpm 离心1分钟。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2分钟，12,000rpm离心1分钟。洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要DNA浓度较高，可以适当减少洗脱体积，但最小体积不应少于50μl，体积过小降低DNA洗脱效率，减少DNA产量。

15.DNA可以存放在2-8℃，如果要长时间存放，可以放置在-20℃。