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支原体DNA提取试剂盒(离心柱型)
Mycoplasma DNA Extraction Kit(SpinColumn)

一.试剂盒组成、储存、稳定性：

试剂盒组成	保存	D2533-50 50T	D2533-100 100T
缓冲液Buffer PE	室温	65 mL	2 x 65 mL
缓冲液Buffer RB	室温	30 mL	60 mL
结合液Buffer CB	室温	11 mL	20 mL
抑制物去除液Buffer IR	室温	25 mL	50 mL
漂洗液Buffer WB	室温	15 mL	25 mL
	第一次使用前按说明加指定量乙醇
洗脱缓冲液Buffer EB	室温	15 mL	15 mL
蛋白酶20mg/mL	-20℃	20 mg	2 x 20 mg
Poly Carrier	-20℃	200 μL	2 x 200 μL
吸附柱Spin AC	室温	50	100
收集管(2mL)	室温	50	100

本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。

二.产品简介：
本试剂盒专为支原体（无细胞壁原核微生物）基因组DNA提取设计，基于硅基质膜特异性吸附核酸的原理，结合支原体细胞膜的结构特点，优化裂解体系与操作条件。独特的Buffer RB与蛋白酶K协同作用，可高效裂解支原体细胞膜（无需溶菌酶），快速释放胞内环状双链基因组DNA并灭活核酸酶；在高离序盐状态下，支原体DNA选择性吸附于离心柱内优质硅基质膜，通过抑制物去除液Buffer IR和漂洗液Buffer WB的两次漂洗，彻底去除细胞代谢物、膜蛋白、杂质及残留酶类；最后用低盐洗脱缓冲液Buffer EB将纯净的支原体基因组DNA从硅基质膜上洗脱，获得高纯度、高得率的DNA产物，可直接用于下游PCR、qPCR、测序、酶切等实验。

三.产品特点：
1.适配性强：吸附柱内硅基质膜经特殊优化，可高效吸附支原体小分子基因组DNA（避免穿滤丢失），柱与柱之间吸附量差异极小，重复性好。
2.安全便捷：无需使用苯酚、氯仿等有毒试剂，无需额外乙醇沉淀步骤，操作简单，单个样品全程可在40~60min内完成。
3.高得率优化：针对支原体无细胞壁、DNA拷贝数低的特点，优化裂解条件与洗脱方式，大幅提升支原体DNA回收效率，低拷贝样本（如细胞培养污染检测）得率可提升3~10倍。
4.高纯度保障：多次漂洗步骤有效去除蛋白、内毒素、盐离子等杂质，提取的DNA OD260/OD280典型比值达1.7~1.9，片段完整性好，可直接满足各类下游分子生物学实验需求。
5.通用性广：可适配各类支原体（如肺炎支原体、解脲支原体等），适用于纯支原体培养物、细胞培养污染样本、临床复杂样本（痰液、泌尿拭子等）的DNA提取。

四.适用范围：
适用于快速提取各类支原体的基因组DNA，包括但不限于：
1.纯支原体培养物（液体/固体培养）；
2. 细胞培养体系（上清液/细胞沉淀，用于支原体污染检测）；
3. 临床样本（痰液、鼻咽拭子、泌尿生殖道拭子、组织匀浆等）；
4. 环境样本（水样、土壤样本中的支原体）。

五.储存条件：
1.结合液Buffer CB或者抑制物去除液Buffer IR低温时可能出现析出和沉淀，可以在37℃水浴几分钟帮助重新溶解，恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。
2.为避免降低活性，方便运输，提供蛋白酶K为冻干粉状，收到后，可短暂离心后，加入1毫升灭菌水溶解，因为反复冻融可能会降低酶活性，因此溶解后立即按照每次使用量(20微升)分装冻存，－20℃保存。
3.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

六.注意事项：
1. 所有试剂使用前请恢复至室温，涡旋混匀，避免试剂分层影响实验效果；Buffer RB、Buffer CB若出现沉淀，可37℃水浴溶解后使用，不影响实验。
2. 蛋白酶K溶液需在-20℃保存，避免反复冻融，使用后立即放回低温环境，失效的蛋白酶K会导致裂解不充分，严重降低得率。
3. 漂洗液Buffer WB必须加入无水乙醇后才能使用，未加乙醇会导致支原体DNA无法被有效洗涤，残留杂质影响下游实验。
4. 支原体无细胞壁，严禁加入溶菌酶，溶菌酶对支原体无作用靶点，不仅无效，还会引入蛋白杂质，降低DNA纯度。
5. 样本处理过程中，离心转速和时间需严格按照步骤要求操作，支原体菌体微小，转速过低、时间过短会导致菌体无法有效沉淀，造成DNA丢失。
6. 操作过程中避免手套接触吸附膜，防止蛋白污染，影响核酸吸附；所有离心管、枪头需使用无菌无酶产品，避免DNA酶污染导致核酸降解。
7. 洗脱缓冲液EB为低盐缓冲液，若后续实验需要高盐环境，可在洗脱后进行乙醇沉淀调整；若无需调整，可直接用于PCR、qPCR等实验。
8. 试剂盒有效期见试剂瓶标签，过期试剂请勿使用；试剂储存请严格按照说明书要求，避免高温、强光直射。

七.操作步骤：（实验前请先阅读注意事项）
提示：第一次使用前请先在漂洗液Buffer WB中加入指定量无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!

第一步：样本预处理，富集支原体菌体，减少杂质干扰，提升得率。
1. 纯支原体培养物（高浓度）：取0.5~2 mL培养菌液（不超过2×109个支原体），12000 rpm离心15min（支原体菌体微小，需提高转速和时间），尽可能吸弃上清，收集菌体沉淀。
2. 细胞培养上清（支原体污染检测，最常用）：取1~5 mL细胞培养上清，加入1/4体积的Buffer PE，4℃静置30min，12000 rpm离心15min，弃上清，收集支原体沉淀（此步骤可大幅富集支原体，提升得率）。
3. 细胞沉淀（支原体污染检测）：取1×106~1×107个细胞沉淀，加入200μL Buffer RB，涡旋振荡重悬，10000 rpm离心30秒，弃上清，保留细胞沉淀（支原体附着于细胞表面，此步骤去除细胞代谢杂质）。
4. 临床复杂样本（痰液、拭子、组织匀浆）：将样本充分匀浆后，取1 mL匀浆液，12000 rpm离心10min，弃上清，沉淀用200μL Buffer RB重悬，重复离心1次，弃上清，收集沉淀；若样本粘液较多，可在重悬时加入5 μL DTT二硫苏糖醇（客户自备），涡旋混匀，室温放置10min，再离心弃上清。
注意：起始样本量可根据支原体密度调整，吸附柱最大吸附能力为20 μg基因组DNA，菌体过量会导致吸附饱和，严重降低得率。

第二步：菌体裂解（核心优化步骤，提升DNA释放效率）
1. 向第一步收集的支原体沉淀中，加入180 μL缓冲液Buffer RB，涡旋振荡或吹打充分重悬，确保沉淀完全分散（无结块）。
2. 加入30~40μL蛋白酶K溶液（20mg/mL，相较于常规细菌提取加倍，支原体细胞膜蛋白与核酸结合紧密，需增加用量），充分涡旋混匀。
3. （可选步骤：若需去除RNA残留，加入4 μL RNase A（100mg/mL，客户自备）溶液，涡旋混匀，室温放置5~10min）。
4. 加入200μL结合液Buffer CB，立刻涡旋振荡15秒充分混匀，56~70℃水浴孵育30-60min（延长孵育时间，确保支原体细胞膜彻底裂解，释放DNA；中间可取出涡旋混匀1~2次，提升裂解效果）。
注意：支原体无细胞壁，无需添加溶菌酶，添加溶菌酶无效且会引入蛋白杂质。
第三步：DNA结合与杂质去除
1. 将上述裂解混合物冷却至室温，加入100μL异丙醇，立刻涡旋振荡15秒充分混匀，此时可能出现絮状沉淀（支原体DNA），混匀不充分会严重降低得率。
2. 可选步骤：低拷贝样本（如细胞培养上清、临床微量样本），加入5 μL Poly Carrier，涡旋混匀，辅助DNA沉淀，提升得率。
3. 将上一步混合物（包括可能有的沉淀）全部加入一个吸附柱Spin AC中（吸附柱放入2 mL收集管中），13000 rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管。
4. 向吸附柱中加入500μL抑制物去除液Buffer IR，12000 rpm离心30秒，弃废液，将吸附柱放回收集管（去除样本中的粘液、腐殖酸等抑制物，尤其适用于临床样本）。
5. 向吸附柱中加入600μL漂洗液Buffer WB（请再次检查是否已加入无水乙醇！），12000 rpm离心30秒，弃废液，将吸附柱放回收集管。
6. 重复上一步操作：再加入600μL漂洗液Buffer WB，12000 rpm离心30秒，弃废液，将吸附柱放回收集管（两次漂洗确保去除残留杂质和盐离子）。

第四步：DNA洗脱与保存
1. 将吸附柱Spin AC放回空的收集管中，13000 rpm离心2min，尽量除去吸附柱中残留的漂洗液，避免残留乙醇抑制下游PCR、酶切等反应。
2. 取出吸附柱Spin AC，放入一个干净的1.5 mL离心管（自备）中，在吸附膜的中间部位加入50~100μL洗脱缓冲液Buffer EB （洗脱缓冲液事先在65~70℃水浴中预热，可提升洗脱效率），室温放置3~5min。
3. 12000 rpm离心1min，收集洗脱液；将得到的洗脱液重新加入该吸附柱中，室温放置2min，12000 rpm离心1min（重复洗脱，提升DNA得率）。
4. 洗脱后的支原体DNA可直接用于下游实验，短期存放（1~7天）可置于2~8℃，长期存放（超过7天）请置于-20℃，避免反复冻融（反复冻融会导致支原体DNA降解）。
注意：洗脱体积越大，洗脱效率越高，但DNA浓度会降低；若需要高浓度DNA，可将洗脱体积调整为30~50μL（最小不低于30μL，否则会降低洗脱效率）。