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无内毒素高纯质粒大量提取试剂盒(离心柱型)

本试剂盒采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞,粗提物通过独特的内毒素清除剂选择性结合离心除去内毒素,然后离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA,再通过漂洗液将杂质和其它细菌成分去除,最后低盐、高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。

产品编号:2209

产品规格:10次

产品价格:1020

包装:

储存条件:4℃

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无内毒素质粒大量快速提取试剂盒(离心柱型)


一.产品介绍:

   本试剂盒采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞,粗提物通过独特的内毒素清除剂选择性结合离心除去内毒素,然后离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA,再通过漂洗液将杂质和其它细菌成分去除,最后低盐、高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。

二.产品特点:
1.离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜,柱与柱之间吸附量差异极小,可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
2.不需要使用有毒的苯酚,氯仿等试剂,也不需要乙醇沉淀。快速, 方便,从150-300 ml大肠杆菌LB((Luria-Bertani)培养液中,可快速提取0.2-1.5mg纯净的高拷贝质粒DNA,提取率达80-90 %。
3.独特配方清除内毒素,内毒素含量极低(<0.1 EU/μg DNA),细胞转染效果极佳。也可直接用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序、等各种分子生物学实验。

三.储存条件:
1.第一次使用时,将试剂盒所带全部的RNase A加入溶液P1后(终浓度100ug/ml)置于4℃保存。如果溶液P1中RNase A失活,提取的质粒可能会混杂有微量RNA残留,在溶液P1中补加RNase A即可。
2.环境温度低时溶液P2中SDS可能会析出出现浑浊或者沉淀,可在37℃水浴加热几分钟,即可恢复澄清,不要剧烈摇晃,以免形成过量的泡沫。
3.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化,各溶液使用后应及时盖紧盖子。

四.注意事项:
1.所有的离心步骤如未加另外说明均在室温完成,使用转速可以达到12,000 x g,带50ml转头的台式离心机。


2.提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb 的大质粒,应加大菌体使用量,同时按比例增加P1、P2、N3 的用量,洗脱缓冲液应在70℃预热。适当延长吸附和洗脱的时间,以增加提取效率。


3.得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。OD260值为1相当于大约50μg/ml DNA。电泳可能为单一条带,也可能为2条或者多条DNA条带,这主要是不同程度的超螺旋构象质粒泳动位置不一造成,与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。本公司产品正常操作情况下基本超螺旋可以超过90%。


4.质粒DNA确切分子大小, 必须酶切线性化后,对比DNA分子量Marker才可以知道。处于环状或者超螺旋状态的的质粒,泳动位置不确定,无法通过电泳知道其确切大小。


5.洗脱液EB不含有螯合剂EDTA,不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱,但应该确保pH大于7.5,pH过低影响洗脱效率。用水洗脱,质粒应该保存在-20℃。质粒DNA如果需要长期保存,可以用TE缓冲液洗脱(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA,pH 8.0),但是EDTA可能影响下游酶切反应,使用时可以适当稀释。

五.操作步骤:(实验前请先阅读注意事项)
    第一次使用前请先在2瓶漂洗液WB瓶中分别加入100 ml无水乙醇,充分混匀,加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇,以免多次加入!
    将RNase A全部加入溶液P1中,混匀,每次使用后置于2-8℃保存。
1.取150-200 ml (最多不超过300 ml)过夜培养的菌液,12,000xg(约10,000rpm),离心1-2分钟,尽可能的倒干上清,收集菌体。
收集超过50毫升菌液,可以离心弃上清后,在同一个50ml管内加入更多的菌液,重复步骤1,直到收集到足够的菌体。


2.用7.5 ml溶液P1重悬菌体沉淀,移液器吹打或者涡旋振荡至彻底悬浮。  
如果有未彻底混匀的菌块,会影响裂解,导致提取量和纯度偏低。


3.加7.5 ml的溶液P2,温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解,室温放置4-5分钟。
温和地混合,不要剧烈震荡,以免基因组DNA剪切断裂!所用时不应超过5分钟!以免质粒受到破坏。此时菌液应变得清亮粘稠。如果很浑浊,可能由于菌体过多,裂解不彻底,应减少菌体量。


4.加7.5 ml溶液N3,立即温和地上下翻转6-8次,充分混匀此时会出现白色絮状沉淀。12,000 x g离心10-15分钟,小心取上清至新管,避免吸取到漂浮白色沉淀。
加入溶液N3后应该立即混匀,以免产生SDS的局部沉淀。


5.加入0.1体积(上清的体积的10%,约2.4ml)的内毒素清除剂到上一步所得上清,颠倒旋转混匀,冰浴或者插入碎冰中(或冰箱冷冻室)放置5分钟直到浑浊变清亮透明(或仍旧稍有浑浊),中间偶尔混匀几次。
内毒素清除剂加入上清后,上清会变得浑浊,但是冰浴后应恢复清亮(或稍浑浊)。


6.常温放置3-5分钟,温度恢复室温溶液很快变为浑浊,颠倒混匀。
如室内温度较低或者想加快速度可以在37-42℃水浴,将很快变浑浊,颠倒混匀。


7.室温8,000-10,000 x g离心10 分钟分相 。上层水相含DNA,下层蓝色油状相含内毒素和其它杂质。将含DNA的上层水相转移到新管(注意不要吸到蓝色油状层,里面含内毒素等杂质),弃油状层。


8.向上层水相中加入0.5体积异丙醇(约11ml)后充分颠倒混匀后分多次(每次不超过15ml)转入吸附柱DC中(吸附柱放入收集管中),12,000 x g离心1分钟,倒掉收集管中的废液。直到所有混合溶液通过此吸附柱。


9.加入10ml漂洗液WB(请先检查是否已加入无水乙醇!),12,000 x g离心1分钟,弃掉废液。再加入10ml漂洗液WB,重复漂洗一次。


10.将吸附柱DC放回空收集管中,最高速(最好大于12,000 x g)离心3分钟以干燥基质膜上残留乙醇,用枪头吸除内圈压环和柱壁之间可能残留的乙醇,打开盖子室温晾干3-5分钟。
该步骤为彻底去除吸附柱中残留乙醇,残留乙醇抑制下游反应并且严重降低洗脱效率,降低质粒产量。


11.取出吸附柱DC,放入一个干净的离心管中,在吸附膜的中间部位加1-2ml洗脱缓冲液EB(洗脱缓冲液事先在 65-70℃水浴中预热可提高产量),室温放置3分钟,12,000 x g离心3分钟。

 
推荐:为了增加质粒的回收效率,可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中,室温放置3分钟,12,000 x g离心3分钟。洗脱两遍可提高浓度约10%。 


洗脱体积越大,洗脱效率越高,如果需要质粒浓度较高,可以适当减少洗脱体积, 但是需注意体积过小降低质粒洗脱效率,减少质粒产量(最小不应少于1ml)。