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无内毒素高纯质粒大量提取试剂盒(离心柱型)

Endo-Free HighPure Plasmid Maxi Extraction Kit(Column)

包装规格：

一.产品介绍：

   本试剂盒采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞，粗提物通过独特的内毒素清除剂选择性结合离心除去内毒素，然后离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后低盐、高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。

二.产品特点：
1.离心吸附柱内硅基质膜采用进口公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
2.不需要使用有毒的苯酚，氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀。快速， 方便，从150-300 ml大肠杆菌LB((Luria-Bertani)培养液中，可快速提取0.2-1.5mg纯净的高拷贝质粒DNA，提取率达80-90 %。
3.独特配方清除内毒素，内毒素含量极低（<0.1 EU/μg DNA），细胞转染效果极佳。也可直接用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序、等各种分子生物学实验。

三.储存条件：
1.第一次使用时，将试剂盒所带全部的RNase A加入溶液P1后（终浓度100ug/ml）置于4℃保存。如果溶液P1中RNase A失活，提取的质粒可能会混杂有微量RNA残留，在溶液P1中补加RNase A即可。
2.环境温度低时溶液P2中SDS可能会析出出现浑浊或者沉淀，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。
3.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

四.注意事项：
1.所有的离心步骤如未加另外说明均在室温完成，使用转速可以达到12,000 x g，带50ml转头的台式离心机。

2.提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb 的大质粒，应加大菌体使用量，同时按比例增加P1、P2、N3 的用量，洗脱缓冲液应在70℃预热。适当延长吸附和洗脱的时间，以增加提取效率。

3.得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。OD260值为1相当于大约50μg/ml DNA。电泳可能为单一条带，也可能为2条或者多条DNA条带，这主要是不同程度的超螺旋构象质粒泳动位置不一造成，与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。本公司产品正常操作情况下基本超螺旋可以超过90%。

4.质粒DNA确切分子大小， 必须酶切线性化后，对比DNA分子量Marker才可以知道。处于环状或者超螺旋状态的的质粒，泳动位置不确定，无法通过电泳知道其确切大小。

5.洗脱液EB不含有螯合剂EDTA，不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱，但应该确保pH大于7.5，pH过低影响洗脱效率。用水洗脱，质粒应该保存在－20℃。质粒DNA如果需要长期保存，可以用TE缓冲液洗脱（10mM Tris-HCl， 1mM EDTA，pH 8.0），但是EDTA可能影响下游酶切反应，使用时可以适当稀释。

五.操作步骤：（实验前请先阅读注意事项）
    第一次使用前请先在2瓶漂洗液WB瓶中分别加入100 ml无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!
    将RNase A全部加入溶液P1中，混匀，每次使用后置于2-8℃保存。
1.取150-200 ml (最多不超过300 ml)过夜培养的菌液，12,000xg（约10,000rpm），离心1-2分钟，尽可能的倒干上清，收集菌体。
收集超过50毫升菌液，可以离心弃上清后，在同一个50ml管内加入更多的菌液，重复步骤1，直到收集到足够的菌体。

2.用7.5 ml溶液P1重悬菌体沉淀，移液器吹打或者涡旋振荡至彻底悬浮。  
如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。

3.加7.5 ml的溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解，室温放置4-5分钟。
温和地混合，不要剧烈震荡，以免基因组DNA剪切断裂！所用时不应超过5分钟！以免质粒受到破坏。此时菌液应变得清亮粘稠。如果很浑浊，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。

4.加7.5 ml溶液N3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀此时会出现白色絮状沉淀。12,000 x g离心10-15分钟，小心取上清至新管，避免吸取到漂浮白色沉淀。
加入溶液N3后应该立即混匀，以免产生SDS的局部沉淀。

5.加入0.1体积(上清的体积的10%，约2.4ml)的内毒素清除剂到上一步所得上清，颠倒旋转混匀，冰浴或者插入碎冰中(或冰箱冷冻室)放置5分钟直到浑浊变清亮透明（或仍旧稍有浑浊），中间偶尔混匀几次。
内毒素清除剂加入上清后，上清会变得浑浊，但是冰浴后应恢复清亮（或稍浑浊）。

6.常温放置3-5分钟，温度恢复室温溶液很快变为浑浊，颠倒混匀。
如室内温度较低或者想加快速度可以在37-42℃水浴，将很快变浑浊，颠倒混匀。

7.室温8,000-10,000 x g离心10 分钟分相 。上层水相含DNA，下层蓝色油状相含内毒素和其它杂质。将含DNA的上层水相转移到新管（注意不要吸到蓝色油状层，里面含内毒素等杂质），弃油状层。

8.向上层水相中加入0.5体积异丙醇（约11ml）后充分颠倒混匀后分多次（每次不超过15ml）转入吸附柱DC中（吸附柱放入收集管中），12,000 x g离心1分钟，倒掉收集管中的废液。直到所有混合溶液通过此吸附柱。

9.加入10ml漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000 x g离心1分钟，弃掉废液。再加入10ml漂洗液WB，重复漂洗一次。

10.将吸附柱DC放回空收集管中，最高速（最好大于12,000 x g）离心3分钟以干燥基质膜上残留乙醇，用枪头吸除内圈压环和柱壁之间可能残留的乙醇，打开盖子室温晾干3-5分钟。
该步骤为彻底去除吸附柱中残留乙醇，残留乙醇抑制下游反应并且严重降低洗脱效率，降低质粒产量。

11.取出吸附柱DC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加1-2ml洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在 65-70℃水浴中预热可提高产量），室温放置3分钟，12,000 x g离心3分钟。

 
推荐：为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置3分钟，12,000 x g离心3分钟。洗脱两遍可提高浓度约10%。 

洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要质粒浓度较高，可以适当减少洗脱体积， 但是需注意体积过小降低质粒洗脱效率，减少质粒产量（最小不应少于1ml）。