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全血/组织/细胞基因组DNA快速提取试剂盒(离心柱型)

独特的结合液/蛋白酶K迅速裂解细胞和灭活细胞内核酸酶,然后基因组DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜, 再通过一系列快速的漂洗-离心的, 抑制物去除液和漂洗液将细胞代谢物、蛋白等杂质去除,最后低盐的洗脱缓冲液将纯净基因组DNA从硅基质膜上洗脱。

产品编号:2511

产品规格:50次/100次/200次

产品价格:540/912/1800

包装:

储存条件:4℃

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全血组织细胞基因组DNA快速提取试剂盒(离心柱型) 


完美替代QIAGEN,51304,QIAamp DNA Mini Kit


一.产品介绍:

独特的结合液/蛋白酶K迅速裂解细胞和灭活细胞内核酸酶,然后基因组DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜, 再通过一系列快速的漂洗-离心的, 抑制物去除液和漂洗液将细胞代谢物、蛋白等杂质去除,最后低盐的洗脱缓冲液将纯净基因组DNA从硅基质膜上洗脱。

二.产品特点:
1.不需要使用有毒的苯酚等试剂,也不需要乙醇沉淀等。
2.快速,简捷,单个样品操作一般可在30分钟内完成。
3.多次柱漂洗确保高纯度,典型的产量200µl全血可提取出3-6µg,OD260/OD280典型的比值达1.7~1.9,长度可达30 kb -50kb,可直接用于PCR、Southern-blot和各种酶切反应。
4.从十几个配方中优选出的红细胞裂解液配方,裂解快速完全,客户可根据需要选择购买。
5.典型的产量200µl全血可提取出3-6µg 基因组DNA。

三.适用范围:
   适用于快速提取全血、各种动植物组织细胞基因组DNA。

四.储存条件:
1.裂解液TL、结合液CB、或者抑制物去除液IR低温时可能出现析出和沉淀,可以在37℃水浴几分钟帮助重新溶解,恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。
2.为避免降低活性,方便运输,提供蛋白酶K为冻干粉状,收到后,可短暂离心后,加入1毫升灭菌水溶解。因为反复冻融可能会降低酶活性,因此溶解后立即按照每次使用量(20微升)分装冻存,-20℃保存。
3.避免试剂长时间暴露于空气中发生挥发、氧化、pH值变化,各溶液使用后应及时盖紧盖子。

五.注意事项:
1.所有的离心均在室温完成,使用转速可以达到13,000 rpm的传统台式离心机,如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。
2.需要自备1XPBS(磷酸盐缓冲液),和异丙醇。
3.不同样品尤其疾病样品中白细胞数量差异可能非常大,因此产量的个体差异也可能非常大。
4.开始实验前将需要的水浴先预热到70℃备用。
5.为了最佳效果,最好使用新鲜血液标本或者4℃存放少于3天的标本,不要使用反复冻融超过3次的标本,否则会严重降低产量。

关于平衡液的使用
1.介绍:核酸吸附硅胶膜柱子长期放置过程中会同空气中的电荷/尘埃发生反应而影响其核酸的结合能力。硅胶柱经平衡液预处理后可大大减少柱子中硅胶膜的憎水基团,提高核酸的结合能力。从而提高硅胶柱子回收效率或者产量。平衡液是强碱性溶液,若不小心碰到,请用大量自来水清洗。用完后需盖紧瓶盖,以免接触空气。室温保存。在保存过程中可能有沉淀生成,请加热至37℃使沉淀完全消失。
2.使用方法:(临用前才预处理)取一个新的硅胶膜吸附柱子装在收集管中,吸取100μl的平衡液至柱子中。13000 rpm离心1分钟,倒掉收集管中废液,将吸附柱子重新放回收集管。此时平衡液预处理柱子完毕。接后续的操作步骤。

六.操作步骤:(实验前请先阅读注意事项)
   提示:第一次使用前请先在漂洗液WB中加入指定量无水乙醇,充分混匀,加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇,以免多次加入!
平衡液预处理吸附柱备用:
使用平衡液预处理硅胶膜吸附柱为必做步骤,具体方法参见前文“关于平衡液的使用”


1.全血
a.取200ul新鲜、冷冻或加入各种抗凝剂的血液,放入1.5ml离心管。
如果全血起始量小于200μl,则用缓冲液BB补足到200μl。如果起始量介于200μl-300μl之间,则后续操作需要按照比例增加试剂用量。如果起始量介于300μl-1ml之间,则需要先进行红细胞裂解操作(见本说明书后附录)。
如果处理血样为禽类、鸟类、两栖类或更低级生物的抗凝血液,其红细胞为有核细胞,因此处理量5-20μl,可加缓冲液BB补足到200μl后进行后续步骤。
b.加入20μl蛋白酶K (20mg/ml)溶液,充分混匀,再加入200μl结合液CB,立刻涡旋振荡充分混匀,在70℃放置10分钟。溶液应变清亮(但颜色偏黑色)。
可选步骤,一般不需要: 如果RNA残留较多,需要去除RNA,可以在加入200μl 结合液CB 前加20μl RNase A(25mg/ml)溶液,振荡混匀,室温放置5-10分钟。
c.冷却后加100μl异丙醇,立刻涡旋振荡充分混匀,此时可能会出现絮状沉淀。
上述步骤中立刻涡旋或者吹打充分混匀非常重要,混匀不充分严重降低产量,必要时如样品粘稠不易混匀时可以涡旋振荡15秒混匀。
d.将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱AC中,(吸附柱放入收集管中)13,000 rpm离心60秒,倒掉收集管中的废液。
e.接操作步骤项下5。


2.组织培养细胞
a.收集约105-106悬浮细胞到一个1.5ml离心管;对于贴壁细胞,应该先用胰蛋白酶消化后吹打下来收集。
b.13,000rpm离心10秒,使细胞沉淀下来。弃上清,留下细胞团和大约10-20μl残留的液体。
c.加200μl 1XPBS重悬洗涤细胞,13,000rpm离心10秒,使细胞沉淀下来。完全吸弃上清, 将细胞沉淀重悬于180μl 1XPBS中。
d.加入20μl蛋白酶K (20mg/ml)溶液,充分混匀,再加入200μl结合液CB,立刻涡旋振荡充分混匀,在70℃放置10分钟。
可选做步骤: 如果RNA残留较多,需要去除RNA,可以在加入200μl 结合液CB 前加20μl RNase A(25mg/ml)溶液,振荡混匀,室温放置5-10分钟。
e.冷却后加100μl异丙醇,立刻涡旋振荡充分混匀,此时可能会出现絮状沉淀。
f.将上一步混合物(包括可能有的沉淀)加入一个吸附柱AC中,(吸附柱放入收集管中)13,000rpm离心60秒,倒掉收集管中的废液。
g.接操作步骤项下5。


3.动植物组织(例如鼠肝脑或者植物叶片)
a.将20-50mg新鲜或者解冻的组织用解剖刀切成小碎块(切成小块可以提高产量)或者在液氮中研磨组织成细粉后,转入装有180μl组织裂解液TL的1.5ml离心管中, 用大口径枪头吹打混匀。
b.加入20μl的蛋白酶K溶液(20mg/ml),立刻涡旋振荡充分混匀。
c.将裂解物放置在55℃水浴1-3小时或者直到组织消化完全,期间轻柔的振荡几次帮助裂解。
可选做步骤: 如果RNA残留较多,需要去除RNA,可在完成步骤c后加20μl RNase A(25mg/ml)溶液,振荡混匀,室温放置5-10分钟。
d.加入200μl 结合液CB,立刻涡旋振荡充分混匀,70℃放置10分钟。
e.冷却后加100μl 异丙醇,立刻涡旋振荡充分混匀,此时可能会出现絮状沉淀。
f.用1ml的枪头吸取混合物,将混合物加入一个吸附柱AC中,(吸附柱放入收集管中)13,000rpm离心60秒,倒掉收集管中的废液。
如果有不溶组织物可能堵住枪头,可将枪头在吸水纸上轻蹭去除不溶物;如果吸上来的混合物少则可以将枪头和不溶物一起弃去,该做法是为了去除不溶物,以免堵塞离心柱。
g.接操作步骤项下5。


4.动物组织(鼠尾)
a.将0.2-0.5cm的鼠尾巴尖(即20-50mg)剪碎(一定要剪0-2cm范围内的尾巴尖,否则裂解效果不好),或者在液氮中研磨组织成细粉后,转入装有180μl组织裂解液TL的1.5ml离心管中, 用大口径枪头吹打混匀。
b.加入20μl的蛋白酶K(20mg/ml),立刻涡旋振荡充分混匀。
c.将裂解物放置在55℃水浴3小时或者直到组织消化完全,期间轻柔的振荡几次帮助裂解。
可选做步骤: 如果RNA残留较多,需要去除RNA,可在完成步骤c后加20μl RNase A(25mg/ml)溶液,振荡混匀,室温放置5-10分钟。
d.用一个1ml不带针头的一次性输液器抽打裂解物2-3次。
e.加入200μl 结合液CB和100μl 异丙醇,立刻涡旋振荡充分混匀。
f.13,000rpm 离心5分钟,将上清加入一个吸附柱AC中,(吸附柱放入收集管中)13,000rpm离心30-60秒,倒掉收集管中的废液。

g.接操作步骤项下5。
上述步骤中立刻涡旋或者吹打充分混匀非常重要,混匀不充分严重降低产量,必要时如样品粘稠不易混匀时可以涡旋振荡15秒混匀。


5.加入500μl抑制物去除液IR,12,000rpm 离心30秒,弃废液。


6.加入600μl漂洗液WB(请先检查是否已加入无水乙醇!),12,000rpm 离心30秒,弃掉废液。


7.加入600μl漂洗液WB,12,000rpm 离心30秒,弃掉废液。


8.将吸附柱AC放回空收集管中,13,000rpm离心2分钟,尽量除去漂洗液, 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。


9.取出吸附柱AC,放入一个干净的离心管中,在吸附膜的中间部位加100μl洗脱缓冲液EB (洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴中预热), 室温放置3-5分钟,12,000rpm 离心1分钟。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中,室温放置2分钟,12,000rpm离心1分钟。


洗脱体积越大,洗脱效率越高,如果需要DNA浓度较高,可以适当减少洗脱体积, 但最小体积不应少于50μl,体积过小降低DNA洗脱效率,减少DNA产量。


10.DNA可以存放在2-8℃,如果要长时间存放,可以放置在-20℃。

附录(以300μl,1ml全血举例红细胞裂解操作):
1.吸取900μl红细胞裂解液到一个1.5ml离心管或者3ml红细胞裂解液到一个15ml离心管。(红细胞裂解液可向本公司购买)
2.将抗凝全血(使用前回复到室温)颠倒混匀后,吸取300μl全血和1ml全血分别加到上述1.5ml和15ml离心管中,颠倒6-8次,并倒置轻弹管壁,确保充分混匀。
3.室温放置10分钟(期间应该颠倒轻弹混匀数次,帮助裂解红细胞)。
4.12,000 rpm离心20秒(对于1.5ml离心管)或2,000-3,000 rpm离心5分钟(对于15ml离心管),倒弃红色上清,并小心的尽可能多的吸弃上清(注意不要吸到管底的细胞团),留下完整的管底白细胞团和大约10μl的残留上清。
离心后在管底应该见到白色的白细胞团,也可能有一些红细胞残片和白细胞团在一起,但是如果看到的是大部分的红色细胞团,说明红细胞裂解很不充分,应该再加入红细胞裂解液重悬细胞团后重复3,4。
5.加入200μl缓冲液BB涡旋振荡重悬白细胞团,充分分散白细胞团。
其中由于肝素抗凝血的白细胞沉淀团很难打散重悬,影响后续实验裂解效果,建议选用非肝素的抗凝剂收集血液标本。
6.现在可以按照操作提取全血基因组DNA了。