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全血组织/细胞基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)

Blood/Tissue/Cell DNA Extraction Kit(Column)

包装规格：

一.产品介绍：

独特的结合液/蛋白酶K迅速裂解细胞和灭活细胞内核酸酶，然后基因组DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜， 再通过一系列快速的漂洗－离心的， 抑制物去除液和漂洗液将细胞代谢物、蛋白等杂质去除，最后低盐的洗脱缓冲液将纯净基因组DNA从硅基质膜上洗脱。

二.产品特点：
1.不需要使用有毒的苯酚等试剂，也不需要乙醇沉淀等。
2.快速，简捷，单个样品操作一般可在30分钟内完成。
3.多次柱漂洗确保高纯度，典型的产量200µl全血可提取出3-6µg，OD260/OD280典型的比值达1.7～1.9，长度可达30 kb -50kb，可直接用于PCR、Southern-blot和各种酶切反应。
4.从十几个配方中优选出的红细胞裂解液配方，裂解快速完全，客户可根据需要选择购买。
5.典型的产量200µl全血可提取出3-6µg 基因组DNA。

三.适用范围：
   适用于快速提取全血、多种动物细胞和动物组织等。

四.储存条件：
1.裂解液TL、结合液CB、或者抑制物去除液IR低温时可能出现析出和沉淀，可以在37℃水浴几分钟帮助重新溶解，恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。
2.为避免降低活性，方便运输，提供蛋白酶K为冻干粉状，收到后，可短暂离心后，加入1毫升灭菌水溶解。因为反复冻融可能会降低酶活性，因此溶解后立即按照每次使用量(20微升)分装冻存，－20℃保存。
3.避免试剂长时间暴露于空气中发生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

五.注意事项：
1.所有的离心均在室温完成，使用转速可以达到13,000 rpm的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。
2.需要自备1XPBS(磷酸盐缓冲液),和异丙醇。
3.不同样品尤其疾病样品中白细胞数量差异可能非常大，因此产量的个体差异也可能非常大。
4.开始实验前将需要的水浴先预热到70℃备用。
5.为了最佳效果，最好使用新鲜血液标本或者4℃存放少于3天的标本，不要使用反复冻融超过3次的标本，否则会严重降低产量。

关于平衡液的使用
1.介绍：核酸吸附硅胶膜柱子长期放置过程中会同空气中的电荷/尘埃发生反应而影响其核酸的结合能力。硅胶柱经平衡液预处理后可大大减少柱子中硅胶膜的憎水基团，提高核酸的结合能力。从而提高硅胶柱子回收效率或者产量。平衡液是强碱性溶液，若不小心碰到，请用大量自来水清洗。用完后需盖紧瓶盖，以免接触空气。室温保存。在保存过程中可能有沉淀生成，请加热至37℃使沉淀完全消失。
2.使用方法：（临用前才预处理）取一个新的硅胶膜吸附柱子装在收集管中，吸取100μl的平衡液至柱子中。13000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中废液，将吸附柱子重新放回收集管。此时平衡液预处理柱子完毕。接后续的操作步骤。

六.操作步骤：（实验前请先阅读注意事项）
  提示：第一次使用前请先在漂洗液WB中加入指定量无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!
平衡液预处理吸附柱备用：
使用平衡液预处理硅胶膜吸附柱为必做步骤，具体方法参见前文“关于平衡液的使用”

1.全血
a.取200ul新鲜、冷冻或加入各种抗凝剂的血液，放入1.5ml离心管。
如果全血起始量小于200μl，则用缓冲液BB补足到200μl。如果起始量介于200μl-300μl之间，则后续操作需要按照比例增加试剂用量。如果起始量介于300μl-1ml之间，则需要先进行红细胞裂解操作（见本说明书后附录）。
如果处理血样为禽类、鸟类、两栖类或更低级生物的抗凝血液，其红细胞为有核细胞，因此处理量5-20μl，可加缓冲液BB补足到200μl后进行后续步骤。
b.加入20μl蛋白酶K (20mg/ml)溶液，充分混匀，再加入200μl结合液CB，立刻涡旋振荡充分混匀，在70℃放置10分钟。溶液应变清亮（但颜色偏黑色）。
可选步骤，一般不需要: 如果RNA残留较多，需要去除RNA，可以在加入200μl 结合液CB 前加20μl RNase A(25mg/ml)溶液，振荡混匀，室温放置5-10分钟。
c.冷却后加100μl异丙醇，立刻涡旋振荡充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。
上述步骤中立刻涡旋或者吹打充分混匀非常重要，混匀不充分严重降低产量，必要时如样品粘稠不易混匀时可以涡旋振荡15秒混匀。
d.将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13,000 rpm离心60秒，倒掉收集管中的废液。
e.接操作步骤项下5。

2.组织培养细胞
a.收集约105-106悬浮细胞到一个1.5ml离心管；对于贴壁细胞，应该先用胰蛋白酶消化后吹打下来收集。
b.13,000rpm离心10秒，使细胞沉淀下来。弃上清，留下细胞团和大约10-20μl残留的液体。
c.加200μl 1XPBS重悬洗涤细胞，13,000rpm离心10秒，使细胞沉淀下来。完全吸弃上清, 将细胞沉淀重悬于180μl 1XPBS中。
d.加入20μl蛋白酶K (20mg/ml)溶液，充分混匀，再加入200μl结合液CB，立刻涡旋振荡充分混匀，在70℃放置10分钟。
可选做步骤: 如果RNA残留较多，需要去除RNA，可以在加入200μl 结合液CB 前加20μl RNase A(25mg/ml)溶液，振荡混匀，室温放置5-10分钟。
e.冷却后加100μl异丙醇，立刻涡旋振荡充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。
f.将上一步混合物（包括可能有的沉淀）加入一个吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13,000rpm离心60秒，倒掉收集管中的废液。
g.接操作步骤项下5。

3.动植物组织（例如鼠肝脑或者植物叶片）
a.将20-50mg新鲜或者解冻的组织用解剖刀切成小碎块（切成小块可以提高产量）或者在液氮中研磨组织成细粉后，转入装有180μl组织裂解液TL的1.5ml离心管中， 用大口径枪头吹打混匀。
b.加入20μl的蛋白酶K溶液(20mg/ml)，立刻涡旋振荡充分混匀。
c.将裂解物放置在55℃水浴1-3小时或者直到组织消化完全，期间轻柔的振荡几次帮助裂解。
可选做步骤: 如果RNA残留较多，需要去除RNA，可在完成步骤c后加20μl RNase A(25mg/ml)溶液，振荡混匀，室温放置5-10分钟。
d.加入200μl 结合液CB，立刻涡旋振荡充分混匀，70℃放置10分钟。
e.冷却后加100μl 异丙醇，立刻涡旋振荡充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。
f.用1ml的枪头吸取混合物，将混合物加入一个吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13,000rpm离心60秒，倒掉收集管中的废液。
如果有不溶组织物可能堵住枪头，可将枪头在吸水纸上轻蹭去除不溶物；如果吸上来的混合物少则可以将枪头和不溶物一起弃去，该做法是为了去除不溶物，以免堵塞离心柱。
g.接操作步骤项下5。

4.动物组织（鼠尾）
a.将0.2-0.5cm的鼠尾巴尖(即20-50mg)剪碎（一定要剪0-2cm范围内的尾巴尖，否则裂解效果不好），或者在液氮中研磨组织成细粉后，转入装有180μl组织裂解液TL的1.5ml离心管中， 用大口径枪头吹打混匀。
b.加入20μl的蛋白酶K(20mg/ml)，立刻涡旋振荡充分混匀。
c.将裂解物放置在55℃水浴3小时或者直到组织消化完全，期间轻柔的振荡几次帮助裂解。
可选做步骤: 如果RNA残留较多，需要去除RNA，可在完成步骤c后加20μl RNase A(25mg/ml)溶液，振荡混匀，室温放置5-10分钟。
d.用一个1ml不带针头的一次性输液器抽打裂解物2-3次。
e.加入200μl 结合液CB和100μl 异丙醇，立刻涡旋振荡充分混匀。
f.13,000rpm 离心5分钟，将上清加入一个吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13,000rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液。

g.接操作步骤项下5。
上述步骤中立刻涡旋或者吹打充分混匀非常重要，混匀不充分严重降低产量，必要时如样品粘稠不易混匀时可以涡旋振荡15秒混匀。

5.加入500μl抑制物去除液IR，12,000rpm 离心30秒，弃废液。

6.加入600μl漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000rpm 离心30秒，弃掉废液。

7.加入600μl漂洗液WB，12,000rpm 离心30秒，弃掉废液。

8.将吸附柱AC放回空收集管中，13,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液， 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

9.取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μl洗脱缓冲液EB （洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴中预热）， 室温放置3-5分钟，12,000rpm 离心1分钟。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2分钟，12,000rpm离心1分钟。

洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要DNA浓度较高，可以适当减少洗脱体积， 但最小体积不应少于50μl，体积过小降低DNA洗脱效率，减少DNA产量。

10.DNA可以存放在2-8℃，如果要长时间存放，可以放置在-20℃。

附录（以300μl，1ml全血举例红细胞裂解操作）：
1.吸取900μl红细胞裂解液到一个1.5ml离心管或者3ml红细胞裂解液到一个15ml离心管。（红细胞裂解液可向本公司购买）
2.将抗凝全血（使用前回复到室温）颠倒混匀后，吸取300μl全血和1ml全血分别加到上述1.5ml和15ml离心管中，颠倒6-8次，并倒置轻弹管壁，确保充分混匀。
3.室温放置10分钟（期间应该颠倒轻弹混匀数次，帮助裂解红细胞）。
4.12,000 rpm离心20秒（对于1.5ml离心管）或2,000-3,000 rpm离心5分钟（对于15ml离心管），倒弃红色上清，并小心的尽可能多的吸弃上清（注意不要吸到管底的细胞团），留下完整的管底白细胞团和大约10μl的残留上清。
离心后在管底应该见到白色的白细胞团，也可能有一些红细胞残片和白细胞团在一起，但是如果看到的是大部分的红色细胞团，说明红细胞裂解很不充分，应该再加入红细胞裂解液重悬细胞团后重复3，4。
5.加入200μl缓冲液BB涡旋振荡重悬白细胞团，充分分散白细胞团。
其中由于肝素抗凝血的白细胞沉淀团很难打散重悬，影响后续实验裂解效果，建议选用非肝素的抗凝剂收集血液标本。
6.现在可以按照操作提取全血基因组DNA了。