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酵母基因组DNA提取试剂盒（含Lytic Enzyme）

包装规格：

一.产品介绍：
该试剂盒采用DNA吸附柱和独有的溶液系统，适合于从多种来源的酵母培养物中快速简单地提取基因组DNA。约3ml处于指数生长期的酵母培养液一般一次抽提可纯化出10-15μg的高质量的基因组DNA。纯化DNA产物可直接用于PCR、酶切和杂交等实验。酵母细胞经lytic Enzyme处理去除细胞壁后，独特的结合液/蛋白酶K迅速裂解细胞和灭活细胞内核酸酶，然后基因组DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜， 再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤， 抑制物去除液和漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质去除， 最后低盐的洗脱缓冲液将纯净基因组DNA从硅基质膜上洗脱。

二.产品特点：
1.离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
2.不需要使用有毒的苯酚等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。
3.快速，简捷，单个样品裂解后操作一般可在30分钟内完成。
4.多次柱漂洗确保高纯度，OD260/OD280典型的比值达1.7～1.9，可直接用于PCR，Southern-blot和各种酶切反应。

三.适用范围：
    适用于快速提取各种酵母基因组DNA。

四.储存条件：
1.结合液CB或者抑制物去除液IR低温时可能出现析出和沉淀，可以在37℃水浴几分钟帮助重新溶解，恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。
2.为避免降低活性，方便运输，提供蛋白酶K为冻干粉状（20mg），收到后，可短暂离心后，加入1毫升灭菌水溶解配制成20mg/ml溶液，因为反复冻融可能会降低酶活性，因此溶解后立即按照每次使用量分装冻存，－20℃保存。
3.Lytic Enzyme为蜗牛酶甘油储液，因此比较粘稠，请小心取用，－20℃保存。 蜗牛酶是从蜗牛的嗦囊和消化道中制备的混合酶，它含有纤维素酶，果胶酶，淀粉酶，蛋白酶等20多种酶。适合破碎溶解各种酵母的细胞壁。
4.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

五.注意事项：
1.所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。
2.需要自备乙醇、异丙醇、 β-巯基乙醇。 
3.开始实验前将需要的水浴先预热到37℃和70℃备用。
4.结合液CB 和抑制物去除液IR中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，用大量清水或者生理盐水冲洗。
5.用户需要自备Sorbitol buffer( 1M 山梨醇， 0.1M Na2EDTA，14 mMβ-巯基乙醇)。配制方法：在600 ml 去离子水里面溶解 182.2克山梨醇，加入200 ml 0.5 M Na2EDTA (pH 8.0) ，不需要调节PH值，定容到1L，4℃保存。临用前加0.2%β-巯基乙醇(商品化的β-巯基乙醇摩尔浓度一般为14M)。
6.菌体浓度检测一般OD600值为1的时候,酿酒酵母细胞是1-2x107 cells/ml，由于菌种和分光度计不同即使同样细胞数量OD值变化也很大，以上仅供参考。
7.洗脱液EB不含有螯合剂EDTA，不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱，但应该确保批pH大于7.5， pH过低影响洗脱效率。用水洗脱DNA应该保存在－20℃。DNA如果需要长期保存，可以用TE缓冲液洗脱（10mM Tris-HCl， 1mM EDTA，pH 8.0），但是EDTA可能影响下游酶切反应，使用时可以适当稀释。

六.操作步骤：（实验前请先阅读注意事项）
   提示：
   第一次使用前请先在15ml漂洗液WB中加入60ml无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!
   吸取使用量的Sorbitol buffer加入0.2%β-巯基乙醇，回复到室温备用。

1.取1-3毫升酵母培养物(不超过3X107 cells，最好是早对数生长期)，12,000rpm离心30秒，尽可能的吸弃上清，收集菌体。
收集超过1.5毫升菌液，可以离心弃上清后，在同一个1.5ml管内加入更多的菌液，重复步骤1，直到收集到足够的菌体。

2.加入300μl Sorbitol buffer，轻柔吹打充分重悬细胞；再加入50μl Lytic Enzyme储液，充分颠倒混匀，37℃温育1-3小时消化细胞壁，中间可颠倒数次帮助消化。
如果破壁效果不好导致产量低，可以加大lytic Enzyme 用量来提高酶工作浓度，还可以延长消化时间或者提高温度到45℃来提高效果，不适合Lytic Enzyme消化的酵母可选用其它方法如0.5mm玻璃珠涡旋击打 ，反复冻融等。玻璃珠法：向菌体中加入180μl 缓冲液YB彻底悬浮菌体，加入0.1g直径为0.45-0.55mm的酸洗玻璃珠，涡旋振荡10分钟，静置几分钟让玻璃珠沉淀，小心吸取上清到一个新管后接后续步骤4。

3.13,000rpm离心1分钟，尽可能吸弃上清，加180μl 缓冲液YB充分重悬细胞团。

4.加入20μl的蛋白酶K溶液(20mg/ml)，立刻涡旋振荡充分混匀。

5.将混合物放置在55℃水浴消化直到消化完全，期间轻柔的振荡几次帮助裂解。
所需消化时间和酵母数量、种类和生长状态有关，一般15分钟即可，但是如果方便的话消化过夜也无不良影响。
可选步骤，一般不需要: 如果RNA残留较多，需要去除RNA，可在完成操作步骤5后加20μl RNase A(25mg/ml)溶液，振荡混匀，室温放置5-10分钟。

6.加入200μl结合液CB，立刻涡旋振荡充分混匀，70℃放置10分钟。 

7.冷却后加入100μl 异丙醇，立刻涡旋振荡充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。

8.将上一步混合物（包括可能有的沉淀）加入一个吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13,000rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液。

9.加入500μl抑制物去除液IR，12,000rpm 离心30秒，弃废液。

10.加入600μl漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000rpm 离心30秒，弃掉废液。

11.加入600μl漂洗液WB，12,000rpm 离心30秒，弃掉废液。

12.将吸附柱AC放回空收集管中，13,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液， 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

13.取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μl洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在 65-70℃水浴中预热效果更好）， 室温放置3-5分钟，12,000rpm 离心1分钟。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2分钟，12,000rpm离心1分钟。
洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要DNA浓度较高，可以适当减少洗脱体积， 但最小体积不应少于50μl，体积过小降低DNA洗脱效率，减少DNA产量。

14.DNA可以存放在2-8℃，如果要长时间存放，可以放置在－20℃。