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海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)

Marine Animal DNA Extraction Kit(Column)

包装规格：

一.产品介绍：

独特的结合液/蛋白酶K迅速裂解细胞和灭活细胞内核酸酶，然后基因组DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜， 再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤， 抑制物去除液和漂洗液将细胞代谢物、蛋白等杂质去除， 最后低盐的洗脱缓冲液将纯净基因组DNA从硅基质膜上洗脱。

二.适用范围：
    适用于快速提取各种海洋动物组织基因组DNA。

三.储存条件：
1.结合液CB或者抑制物去除液IR低温时可能出现析出和沉淀，可以在37℃水浴几分钟帮助重新溶解，恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。
2.为避免降低活性、方便运输，提供蛋白酶K为冻干粉状，收到后，可短暂离心后，加入1ml灭菌水溶解，因为反复冻融可能会降低酶活性，因此溶解后立即按照每次使用量(20微升)分装冻存，－20℃保存。
3.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

四.注意事项：
洗脱液EB不含有螯合剂EDTA，不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱，但应该确保批pH大于7.5， pH过低影响洗脱效率。用水洗脱DNA应该保存在－20℃。DNA如果需要长期保存，可以用TE缓冲液洗脱（10mM Tris-HCl， 1mM EDTA，pH 8.0），但是EDTA可能影响下游酶切反应，使用时可以适当稀释。

五.操作步骤：（实验前请先阅读注意事项）
   提示：第一次使用前请先在漂洗液WB中加入指定量无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!
1.切取不多于30mg 的组织材料，放入装有180μl组织裂解液SL的1.5ml离心管中，涡旋振荡15 秒。
  根据提取的组织不同，起始量也稍有不同，腮的细胞量较大，一般建议提取量不超过20mg。如果裂解困难，可先用液氮研磨。

2.加入20μl的蛋白酶K溶液(20mg/ml)，立刻涡旋振荡充分混匀。将裂解物放置在55℃水浴1-3小时或者直到组织消化完全。
不同组织裂解时间不同，通常需0.5–2小时即可完成。扇贝组织0.5小时基本可裂解完全，虾和鱼类组织1小时。每小时振荡混合样品2-3次，每次振荡混匀15 秒。
可选做步骤: 如果RNA残留较多，需要去除RNA，可在完成步骤2后加20μl RNase A(25mg/ml)溶液，振荡混匀，室温放置5-10分钟。

3.加入200μl 结合液CB，立刻涡旋振荡充分混匀，70℃放置10分钟。

4.冷却后加100μl 异丙醇，充分颠倒或涡旋振荡充分混匀，此时可能出现絮状沉淀。

5.将上一步混合物和可能的沉淀都加入一个吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13,000rpm离心60秒，倒掉收集管中的废液。
如果有不溶组织物可能堵住枪头，可将枪头在吸水纸上轻蹭去除不溶物；如果吸上来的混合物少则可以将枪头和不溶物一起弃去，该做法是为了去除不溶物，以          免堵 塞离心柱。
上述步骤中立刻涡旋或者吹打充分混匀非常重要，混匀不充分严重降低产量，必要时如样品粘稠不易混匀时可以涡旋振荡15秒混匀。

6.加入500μl抑制物去除液IR，12,000rpm 离心30秒，弃废液。

7.加入600μl漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000rpm 离心30秒，弃掉废液。

8.加入600μl漂洗液WB，12,000rpm 离心30秒，弃掉废液。

9.将吸附柱AC放回空收集管中，13,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液， 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

10.取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μl洗脱缓冲液EB （洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴中预热效果更好）， 室温放置3-5分钟，12,000rpm 离心1分钟。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2分钟，12,000rpm离心1分钟。
洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要DNA浓度较高，可以适当减少洗脱体积， 但是最小体积不应少于50μl，体积过小降低DNA洗脱效率，减少DNA产量。

11.DNA可以存放在2-8℃，如果要长时间存放，可以放置在－20℃。