产品中心

castPCR Genotyping Master Mix

包装规格：

储运温度：

-20℃长期保存，避免反复冻融，短期使用可放4℃。

产品说明：

castPCR Genotyping Master Mix是采用Taqman探针法竞争性等位基因特异性PCR技术（Competitive Allele-Specific Taqman PCR，castPCR）进行SNP分析以及检测InDels (Insertions and Deletions，插入和缺失)的专用2 x 预混液，只需要额外加入预先设计好的Allele 1特异检测引物，Allele 2特异检测引物，Locus特异扩增引物，模板和灭菌蒸馏水即可进行SNP分析以及检测InDels，使用方便，采用全自动核酸提取仪、PCR仪，3 种荧光的荧光定量PCR 仪或多通道荧光读板机（酶标仪），灵活采用96孔板、384孔板，一天可检测几万个SNP 位点。

精心研制的抗体修饰热启动Taq酶，Allele 1 FAM 荧光通用引物和Allele 2 HEX 荧光通用引物，配合反复优化的Buffer，增强了在低浓度和复杂模板上的分型成功率，同时本产品提供ROX Reference Dye用于校正加样孔之间的体积误差和荧光信号误差，不用Reference Dye校正的qPCR扩增仪器，使用时无需添加ROX。

实验过程：

用Real-time PCR system型荧光定量PCR仪，采用基因分型-终点测定法对样品进行检测。96孔PCR 板及384 孔板最小反应体系分别为10μL和5μL。

1. 反应液的配置分装，务必使用无污染的新吸头，EP管，尽量避免污染。

2. 溶解所有用到的试剂，轻柔上下颠倒混匀，短暂瞬时离心将溶液甩至管底；

3.按下列组份配制qPCR混合液，将除模板以外的试剂混成mix，再分装到单个PCR管内，最后加入模板DNA。

注意：长期保存2 x castPCR Genotyping Master Mix置于-20℃，4℃保存可保存1周，冻融请勿超过 3 次。

4.短暂瞬时离心后放入荧光定量PCR仪中运行，qPCR反应程序如下：

5.其他循环条件:

   如果未获得明确的基因分型簇，则应将平板热循环额外3-10个循环，并再次读取。

分型失败问题分析：

若分型失败，请尝试以下几种解决方案：

（1）DNA 浓度过低。保证每个反应体系内有 10ng 以上模板DNA，大基因组物种如小麦，请保证 100ng 以上。

（2）DNA 含有大量 PCR 抑制剂，请将模板进行梯度稀释再次尝试，或者重新纯化 DNA。

（3）DNA 浓度严重不均一，分型较差的样本 DNA 含量过低。请重新准备 DNA 样本。

（4）PCR 循环太少。

（5）实际上分型已经成功，但群体中只有一种等位基因型，因缺乏其它等位基因的对照，导致分型误判。

（6）引物自身扩增差。请更换扩增好的引物进行实验。

（7）引物失效，请重新合成引物。

（8）试剂失效。请在有效期内使用 。请将待使用的 试剂储存在-20℃冰箱中，并减少冻融次数。

（9）使用不合格 PCR 板（管），请确认该耗材可以正常进行 PCR 扩增。在洁净度差的场所生产的板子，或者某些带有荧光增白剂的 PCR 板（尤其是部分白色板子），有非常严重的自荧光现象，导致信号异常。

（10）若只有杂合和一种亲本等位基因型，缺少另一种亲本等位基因型。A)请检查群体是否为回交世代；B） 异源多倍体的位点多拷贝现象，请设计单一拷贝特异引物；C）该等位突变纯合致死，无纯合现象，或纯合现象罕见。

（11）若出现单个严重离群点，请检查：A）该 PCR 孔内是否有颜色污染；B）该 PCR 孔是否漏加/破损泄露/ 蒸发。请删除该数据点，并重新实验。

背景知识：

等位基因特异扩增（Allele specific PCR, ASP）

在 PCR 技术发明几年后的 1988年，等位基因特异扩增（ASP）/扩增受阻突变体系（Amplification refractory muta- tion system，ARMS）技术出现。该技术原理简单，即利用引物3’最后1~4个尤其是最后1个碱基的差异，区分并特异扩增特定等位基因 DNA 片段。

天然 DNA 聚合酶对 3’最后几个碱基的复性匹配/错配选择并不好，早期应用该技术须有额外的手段保证选择性。如在引物末端人为引入新错配，或者调整 PCR 退火温度， 但这些手段相对复杂且有稳定性问题，一直困扰着这个原理简单的 SNP 分型技术，因而应用并不广泛 。

KASP技术从根本上解决了 DNA 聚合酶及 PCR 体系对 SNP 识别的问题，能严格进行特异扩增，产生正确的等位基因扩增信号。

荧光共振能量转移（Fluorescence resonance energy transfer，FRET）

荧光基团和对应荧光淬灭基团距离较近时，荧光基团发出的荧光，会被淬灭基团吸收，发射出更长波长的荧光或者放出热量。此时在此荧光对应的波长内检测不到该基团荧光信号。一旦二者分离， 则荧光信号可被检测到。

采用了 FRET 原理来检测 FAM 以及 HEX 荧光引物的扩增信号，对应的等位基因发生扩增时，将出现对应的荧光信号。