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产品规格：

产品介绍：

本制品是采用Probe探针杂交法进行Real Time PCR的专用试剂。将HotStart Taq DNA polymerase、dNTP、氯化镁、特殊稳定剂、优化的反应缓冲液等试剂，预混成一种适合Real Time PCR反应检测用 2 × Premix Type试剂，减少PCR扩增操作时间，避免因多步操作带来的污染，具有灵敏度高、特异性强、稳定性好等特点。本品采用全新的HotStart Taq DNA polymerase可以有效抑制非特异的PCR扩增，大大提高扩增效率，进行高灵敏度的Real Time PCR反应。

－20 ℃ 保存可保存1年，使用前充分融解混匀。短期使用可放在4 ℃，避免反复冻融。

使用方法：

3.1. 反应体系配制
（1）溶解并混匀PCR反应所需的各种溶液，放置于冰浴或冰盒内。建议反应PCR液体分装使用，避免反复冻融。

（2）以50μl总反应体积为例准备反应体系。如果反应体积有变化，按比例调整用量。

建议PCR条件(分别以10μl，25 μl，50μl反应体系为例，反应液配制请在冰上进行)

备注：

1) 引物终浓度应在0.1-0.6μM之间进行调节。一般情况下，终浓度为0.2μM的引物可以得到较好的结果；探针终浓度可在50nM-250nM之间进行调整。
2) 关于加入模板的量，对于模板是基因组DNA，建议的模板量是10pg-1ug； 对于模板是反转后得到的cDNA，使用体积不超过qPCR反应液总体积的1/10，即20ul体系建议最多加入2ul cDNA，以此类推。
3) 各组分添加完之后，轻柔混匀反应液。如果产生气泡，低速离心以除去气泡。

3.2. 反应条件设置
以ABI 7500机型测试为例：

1) 预变性时间设置：由于本试剂用到的是抗体修饰酶，需要热激活处理，一般建议预变性时间设为95℃，3min。 
2) 退火温度和时间设置：请根据引物的Tm值和目的基因的长度进行调整。 
3) 荧光信号采集设置：请按照所使用的仪器需要的最短时间限制进行调整，即Roche LightCycler 时长设定为20sec、ABI7700/7900HT/7500Fast时长设定为30sec、ABI 7000和ABI7300时长设定为31sec、ABI7500时长设定为34sec。

4. 结果分析：
4.1.扩增结束无扩增曲线：
1）模板量过少或已降解，提供高浓度和高质量模板；
2）引物是否降解，可以通过PAGE胶确定其完整性；
3）反应循环数不够，一般将循环数设为40-45个循环；
4）确认PCR程序设置中是否设置了荧光采集过程。

4.2.CT值出现过晚：
  1）扩增效率低，反应条件不够优化，可适当降低退火温度；
  2）模板浓度过低或加样量不足；
  3）PCR产物过长，一般PCR产物推荐长度为80-150bp。

4.3.阴性对照有明显扩增：
1）Mix液、ddH2O、引物和探针可能存在污染，更换新的重新进行实验。