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OliGreen ssDNA 定量检测试剂盒

【包装规格】

【保存条件】

本产品2-8℃避光保存，有效期 6个月，Oligonucleotide standard 如需长期保存可置于–20°C 。

【产品简介】

OliGreen是一种超高灵敏度的荧光核酸染料，专用于溶液中寡核苷酸与单链 DNA（ssDNA）的定量。借助荧光素激发/发射波长，使用荧光酶标仪即可定量低至 1 ng/mL 的寡核苷酸或 ssDNA（200 µL 体系下约 200 pg）。OliGreen在常规荧光仪上的线性检测范围跨越 4 个数量级（100 pg/mL 至 1 µg/mL），仅需单一染料浓度即可完成。研究证实，其在常见核酸污染物（盐、尿素、乙醇、氯仿、去污剂、蛋白质、ATP、琼脂糖等）存在下仍能保持线性，但部分化合物会影响信号强度。

该试剂对 6 个碱基以下的核苷酸与短寡核苷酸不产生干扰；但与双链DNA（dsDNA）及 RNA 结合时同样会出现荧光增强，且表现出明显的碱基选择性：与 poly(dT) 结合时荧光增强最显著，poly(dG) 次之，poly(dA)、poly(dC) 信号很弱。因此制作标准曲线时应使用碱基组成与待测样品相近的寡核苷酸。结合核酸后的近似荧光激发/发射最大值约为 500 / 525 nm；仪器测定常用荧光素波长（激发 ~480 nm，发射 ~520 nm）。

【产品特点】

1. 超高灵敏度：最低可检测 1 ng/mL 寡核苷酸/ssDNA（200 µL 体系下 200 pg）。

2. 宽线性范围：单一染料浓度即可覆盖 100 pg/mL – 1 µg/mL（4 个数量级）。

3. 抗污染干扰：盐、尿素、乙醇、氯仿、去污剂、蛋白、ATP、琼脂糖等存在下仍保持线性（信号强度可能变化）。

4. 平台兼容：适配荧光酶标仪、分光荧光计及荧光计，亦可用于 96 孔板、384 孔板或比色皿。

5. 波长友好：荧光素通道（Ex ~480 / Em ~520 nm，最大 500/525 nm），无需特殊滤光片。

6. 配套完整：含试剂、10× TE 缓冲液及 18-mer M13 测序引物标准品，开盒即可实验。

【操作步骤】（实验前请先阅读注意事项）

1. 检测缓冲液（1× TE 工作液）配制：

用无菌、无核酸酶蒸馏水将 10× TE 缓冲液作 10 倍稀释，得到 1× TE 工作液。TE 必须无核酸酶、无核酸污染，否则会引入背景。

2. 染料工作液配制：

开瓶前先将试剂回温至室温。临用前，OliGreen原液（200× in DMSO）按 1:100 用 1× TE 缓冲液稀释，配制成 2× 染料工作液。200 µL 体系下，每个样品需 100 µL 工作液。

注意：建议使用塑料容器配制（试剂易吸附于玻璃表面）；工作液需避光（试剂易光降解），制备后请在数小时内使用。

3. 高范围寡核苷酸标准品制备：

将试剂盒提供的 100 µg/mL 标准品用 TE 作 50 倍稀释即得 2 µg/mL（如 4 µL 标准品 + 196 µL TE）。取 50 μL（2 µg/mL）标准品 + 50 μL 1× TE → 1 µg/mL；取 10 μL（2 µg/mL）+ 90 μL 1× TE → 200 ng/mL；取 1 μL（2 µg/mL）+ 99 μL 1× TE → 20 ng/mL；取0 μL（2 µg/mL）标准品 +100 μL 1× TE作为空白对照；这样依次倍比稀释后，配成系列高范围标准品工作液。

4. 低范围寡核苷酸标准品制备：

先将 2 µg/mL 标准品作 20 倍稀释得 100 ng/mL 储备液。取 10 μL（100 ng/mL）标准品 + 90 μL 1× TE → 10 ng/mL；取 2 μL（100 ng/mL）+ 98 μL 1× TE → 2 ng/mL；取0 μL（2 µg/mL）标准品 +100 μL 1× TE作为空白对照；这样依次倍比稀释后，配成系列低范围标准品工作液。

5. 标准曲线绘制：

每孔加入 100 µL 水溶液 OliGreen 工作液，混匀，室温避光孵育 2–5 分钟。用荧光酶标仪、荧光素波长（激发 ~480 nm，发射 ~520 nm）测定荧光强度，扣除试剂空白荧光值，以荧光强度对寡核苷酸浓度绘制标准曲线，根据标准曲线的线性回归方程，计算待测样品浓度，再乘以稀释倍数即为原样品浓度。

五. 结果分析

1. 以标准品浓度（ng/mL）为横轴、扣除空白后的荧光强度为纵轴进行线性回归，得到标准曲线方程 y = a*x + b（R²>0.99 为合格）。待测样品浓度 x = (y_样品 − b) / a，再乘以样品稀释倍数。

2. 线性最佳区间：高范围 10 ng/mL – 1 µg/mL，低范围 1 – 50 ng/mL，整体线性跨越约 100 pg/mL – 1 µg/mL（4 个数量级）。若样品荧光超出线性上限，应将样品稀释后重新测定并计入稀释倍数；若低于检测下限，可适当增大样品体积或浓缩后测定。

注意：建议将增益设为使最高浓度标准品接近酶标仪满量程；低范围测定可适当提高增益以提升灵敏度；为获得最高准确度，标准品应与实验样品在相同污染物水平、相同处理方式下制备；建议用不同稀释度重复测定进行交叉验证。

六. 注意事项

1. 本产品仅用于科研，禁止用于医药、临床医疗、食品和化妆品等用途。

2. 荧光染料均存在淬灭问题，请尽量避光操作，以减缓荧光淬灭。

3. OliGreen 对 ssDNA 极敏感，所用 TE 必须无核酸酶、无核酸污染，否则会显著抬高背景。

4. 试剂对光敏感易发生光降解，工作液须避光保存，且所有孵育与测定步骤应避光进行。

5. 染料工作液最好现配现用，以保证最佳结果；配制后建议数小时内使用完毕。

6. 试剂与 dsDNA、RNA 结合亦会产生荧光增强，且对碱基组成敏感（偏好 poly(dT)）。制作标准曲线时，应使用长度与碱基组成与待测样品相近的寡核苷酸/ssDNA。

7. 荧光强度受温度影响较大，绘制标准曲线与样品测定应在同一恒定温度下进行（建议室温，混匀后避光孵育 2 min 再读）。

8. 所有样品与标准品的荧光测定时间应保持一致，以减小光漂白带来的偏差；增益设置应使最高浓度接近满量程。

9. 标准品与样品混匀时避免涡旋产生气泡；比色皿侧面请勿标注，以免影响荧光信号采集。

10. 原液为 DMSO 溶液，2–8℃ 避光保存、避免反复冻融；DMSO 为可燃液体，请远离热源与明火，存放于通风良好处。

11. 染料易吸附于玻璃表面，请使用塑料容器配制，并避免与玻璃器皿长时间接触。

12. 本试剂经皮肤可吸收，操作时请穿实验服、戴一次性手套；避免接触眼睛与皮肤，如接触立即用大量水冲洗。