技术服务

DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一，真核生物中的甲基化仅发生于胞嘧啶，即在DNA甲基化转移酶（DNMTs）的作用下使CpG二核苷酸5’-端的胞嘧啶转变为5’-甲基胞嘧啶。DNA甲基化通常抑制基因表达，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。这种DNA修饰方在不改变基因序列前提下实现对基因表达的调控。脊椎动物DNA的甲基化状态与生长发育调控密切相关，比如在肿瘤发生时，抑癌基因CpG岛以外的CpG序列非甲基化程度增加，CpG岛中的CpG则呈高度甲基化状态，导致抑癌基因表达的下降。

1.甲基化特异性的PCR（Methylation-specific PCR，MSP）
用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变；随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR。通过电泳检测MSP扩增产物，如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在甲基化；反之，说明被检测的位点不存在甲基化。 

特点：适用范围广，能够检测特异位点是否发生甲基化。

2.亚硫酸氢盐测序法（Bisulfite sequencing PCR，BSP）
用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。随后设计BSP引物进行PCR，在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶，最后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化，称为BSP-直接测序法。将PCR产物克隆至载体后进行测序，可以提高测序成功率，这种方法称为BSP-克隆测序法。

特点：精确度高，能够准确检测出甲基化的程度百分比。

3.焦磷酸测序（Pyrosequencing）

焦磷酸测序可在一次检测中快速定量一个或多个甲基化位点，是较为理想的验证方法，该技术在表观遗传学研究中逐渐成为数据分析的金标准。 灵敏度高，可测到邻近CpG区域的单个甲基化水平 ，对于样品要求低，适用于新鲜、冷冻和FFPE样本，对于检测位点要求低，可检测未知序列信息，覆盖到人类基因组的所有CpG位点。

实验过程：
1.引物设计及合成
2.DNA提取、质检
3.DNA亚硫酸氢盐修饰
4.MSP/BSP/焦磷酸测序
5.数据分析

送样要求：细胞（≥106 个）、组织（≥300mg）、血液（≥1ml）、血清（≥1.5ml）等样品材料，基因组DNA（体积≥20μl，浓度≥50 ng/μl）。

提交的结果：
MSP：引物序列、实验报告、包括MSP产物的电泳图片等

BSP：引物序列、测序峰图、实验报告等

焦磷酸测序：引物序列、测序峰图、实验报告等