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miRNA cDNA Synthesis Kit(miRNA第一链合成试剂盒)

miRNA cDNA Synthesis Kit(miRNA第一链合成试剂盒)

产品编号:4205

产品规格:25T/100T

产品价格:1500/5700

包装:

储存条件:F

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miRNA cDNA Synthesis Kit(miRNA第一链合成试剂盒)


包装规格:

编号 产品名称 规格 目录价
4205A miRNA cDNA Synthesis Kit(miRNA第一链合成试剂盒) 25T 1500
4205B miRNA cDNA Synthesis Kit(miRNA第一链合成试剂盒) 100T 5700


产品介绍:

miRNA第一链合成试剂盒本试剂盒采用在 miRNA 3’末端加多聚A 尾Poly(A),再使用Anchored oligo(dT)-universal tag 通用逆转录引物进行逆转录反应,最终生成miRNA 对应的cDNA 第一链。miRNA cDNA第一链合成试剂盒包含miRNA 3’末端Poly(A)修饰过程和逆转录过程的所有试剂,该试剂盒具有高效的Poly(A)修饰和逆转录效率, 可从20pg-2μg 的total RNA 中有效制备miRNA 对应的cDNA 第一链。一次合成的cDNA可检测多个microRNA,节约了样品和成本。
注:该试剂盒须与 miRNA 荧光定量检测试剂盒(4308A和4309A)配套使用。

操作步骤:
一、miRNA 3’末端进行加Poly (A)处理
1. 在冰上预冷RNase free 的反应管内加入以下试剂至总体积20μl (最后加入E.coli Poly(A) Polymerase)

 Components Volumn Final Concentration
Total RNA xμl Up to 2μg
E.coliPoly(A) Polymerase(5U/μl)  0.4μl(见注意事项) 2U
10×Poly(A) Polymerase Buffer 2μl 1 X
10× rATP solution 2μl 1 X
RNase free H2O to final volume 20μl

注意事项:E.coli Poly(A) Polymerase(5U/μl)非常粘稠和微量,溶液容易吸附在管壁和吸头外导致损失,用前请点甩离心后使用,并且避免吸头外壁沾附损失。可以每次按照0.3μl使用,也不影响使用效果。
*在反应中使用的total RNA 必须含有小分子RNA。
*此过程也可以使用小分子RNA(建议加入量为2μl ~4μl。请根据目的miRNA丰度决定加入量)。
2. 移液器轻轻混匀上述配制的反应液,短暂离心后在37℃反应30-60 min。所得的Poly(A)反应液可以立即进行第一链合成,也可以放置-20℃短暂保存。如需长期保存建议存放于-80℃。

二、加Poly (A)修饰后的miRNA 进行逆转录反应(第一链合成)
1. 按照下表组分冰上进行反应液的配制
Components Volume
上述Poly(A)反应液  2 -4μl
25μmol RT primer 2 μl
5×RT Reaction Mix 4 μl
TUREscript Hˉ RTase (200U/μl) 0.8-1μl (见注意事项)
RNase free H2O to final volume  20 μl

注意事项:TUREscript Hˉ RTase非常粘稠,溶液容易吸附在管壁和吸头外导致损失,用前请点甩离心后使用,并且避免吸头外壁沾附损失。可以每次按照0.8μl使用,也不影响使用效果。
2. 移液器轻轻混匀上述配制的反应液,短暂离心后在42℃反应50min。
3. 70℃加热15 min失活TUREscript Hˉ RTase。合成的cDNA反应液可放置于-20℃保存;也可以直接进行下游PCR或者荧光定量PCR检测。

注:按照上述操作步骤得到的cDNA模板用于下游PCR或者荧光定量PCR检测时,可以根据实际情况选择使用量,如果发现有非特异扩增条带,或者融链曲线显示有非特异扩增,往往提示cDNA模板过量, 可以将上述cDNA模板稀释几十到几百倍甚至上千倍再使用。