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Components	Volumn	Final Concentration
Total RNA	xμl	Up to 2μg
E.coliPoly(A) Polymerase(5U/μl)	0.4μl(见注意事项)	2U
10×Poly(A) Polymerase Buffer	2μl	1 X
10× rATP solution	2μl	1 X
RNase free H2O to final volume	20μl

注意事项：E.coli Poly(A) Polymerase(5U/μl)非常粘稠和微量，溶液容易吸附在管壁和吸头外导致损失，用前请点甩离心后使用，并且避免吸头外壁沾附损失。可以每次按照0.3μl使用，也不影响使用效果。
*在反应中使用的total RNA 必须含有小分子RNA。
*此过程也可以使用小分子RNA（建议加入量为2μl ~4μl。请根据目的miRNA丰度决定加入量）。
2. 移液器轻轻混匀上述配制的反应液，短暂离心后在37℃反应30-60 min。所得的Poly(A)反应液可以立即进行第一链合成，也可以放置-20℃短暂保存。如需长期保存建议存放于-80℃。

二、加Poly (A)修饰后的miRNA 进行逆转录反应（第一链合成）
1. 按照下表组分冰上进行反应液的配制

Components	Volume
上述Poly(A)反应液	2 -4μl
25μmol RT primer	2 μl
5×RT Reaction Mix	4 μl
TUREscript Hˉ RTase (200U/μl)	0.8-1μl (见注意事项)
RNase free H2O to final volume	20 μl

注意事项：TUREscript Hˉ RTase非常粘稠，溶液容易吸附在管壁和吸头外导致损失，用前请点甩离心后使用，并且避免吸头外壁沾附损失。可以每次按照0.8μl使用，也不影响使用效果。
2. 移液器轻轻混匀上述配制的反应液，短暂离心后在42℃反应50min。
3. 70℃加热15 min失活TUREscript Hˉ RTase。合成的cDNA反应液可放置于-20℃保存；也可以直接进行下游PCR或者荧光定量PCR检测。

注：按照上述操作步骤得到的cDNA模板用于下游PCR或者荧光定量PCR检测时，可以根据实际情况选择使用量，如果发现有非特异扩增条带，或者融链曲线显示有非特异扩增，往往提示cDNA模板过量， 可以将上述cDNA模板稀释几十到几百倍甚至上千倍再使用。