唾液直接PCR试剂盒
Saliva Direct PCR Kit
一.试剂盒组成、储存、稳定性
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Contents
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Storage
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P4405-100
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P4405-500
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100T x 20 µL
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5 x 100T x 20 µL
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2 x Fast Direct PCR Mix
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-20℃
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1 mL
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5 x 1 mL
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Quick Extract buffer A
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-20℃
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4 x 2 mL
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5 x 8 mL
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Quick Extract buffer B
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-20℃
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5 x 2 mL
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5 x 10 mL
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二.产品介绍
本试剂盒可以在15‑20分钟内，从唾液，口腔拭子和培养细胞中直接分离基因组DNA 用于PCR扩增检测。该方法不需要用复杂的仪器，以及各种专用的核酸基因组DNA提取试剂盒来提取纯化基因组DNA，该试剂盒也可以直接对提取好的基因组DNA进行PCR扩增。
三.产品特点
1. Easy：快速制备的基因组DNA，可以用2 x Fast Direct PCR Mix直接上机检测。
2. Quick：可以在15‑20分钟内一步制备多种材料的基因组DNA。
3. Versatile：可以处理唾液，口腔拭子和培养细胞等多种样品。
4. Sensitivity：只需及其微量的基因组DNA即可反应。
5. Specificity：适用于各种PCR反应，扩增速度快，扩增产量高，具有高扩增效率、高扩增产量、高保真度等特点，可以快速、准确地对目的基因进行检测。
四.适用范围
适用于唾液，口腔拭子和培养细胞的快速基因组DNA制备，用于PCR扩增，具有高扩增效率、高扩增灵敏度、高扩增特异性的特点，可以快速、准确地对目的基因进行检测。
五.储存条件及有效期
‑20℃±5℃保存、4℃运输、避免多次反复冻融，有效期12个月。
六.自备仪器试剂
上下游引物，水浴锅，金属浴，离心机，振荡混合器，梯度PCR仪，PCR反应管和八联排，无酶1.5 mL离心管，滤芯吸头(规格:10 µL，200 µL，1000 µL)，各种规格的移液器。
七.样品要求
1.根据实际情况采样，推荐采用标准唾液采集管和唾液保存液采集保存唾液样品。
2.应避免样本间交叉污染，样本采集后应及时检测，也可保存于‑20±5℃待检，长期保存应置于‑70℃以下。
八.样品保存和运输
上述标本短期内可保存于‑20℃，长期保存可置‑70℃，但不能超过6个月，标本运送应采用2~8℃冰袋运输，严禁反复冻融。
九.唾液样品收集
1. 用清水漱口1～2次，然后吐掉。
2. 漱口后等候至少5分钟方可采集唾液，期间不要进食、饮用各种饮料。
3. 将唾液(不是喉咙中痰液)吐到5 mL 采集管中，直至2 mL 刻度位置。(不可将痰液吐到收集管中，若唾液不足，可做口舌运动，促进分泌。浮在唾液上层的少量泡沫不包括计算在2 mL唾液采集量内，采集过程必须在30分钟内完成)
4. 将等体积2 mL保存液全部倒在5 mL唾液采集管中，充分颠倒混匀后旋紧盖子。
十.使用方法
1.DNA制备（样本处理区）
1.1 新的PCR管，EP管中可加入如下样品：
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样品类型
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样品处理方式
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唾液
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将装唾液的收集管混匀悬浮后，取500‑1000 µL唾液转移至1.5 mL灭菌离心管中，13,000 rpm离心1‑2 min，吸弃上清液留管底细胞团用于DNA的制备，如果采用PCR仪加热需转移细胞团到PC管中。
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口腔拭子
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准备1.5 mL EP管，口腔拭子浸泡于500‑1000 µL生理盐水中，旋涡震荡30s后浸泡3‑5 min，将拭子贴离心管壁挤干液体，13,000 rpm离心2‑3 min，吸弃上清留管底脱落细胞。
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培养细胞
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5‑10 µL细胞（浓度105‑107），1 x PBS重悬漂洗，13,000 rpm离心1min，吸弃上清留管底细胞。
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1.2 根据样品体积不同加入适量体积Quick Extract buffer A，每个样品孔加50‑80 µL，吹打混匀样品，确保样品分散悬浮。
1.3 对PCR仪，金属浴或水浴锅设置反应程序：60℃加热10‑15 min，98℃加热10‑15min，4℃降温或冰浴冷却。
1.4 加入50‑80 µL Quick Extract buffer B，吹打混匀，微量离心管13,000 rpm离心3 min。
1.5 吸取离心后透明上清液转移到干净的PCR管或EP管中，取2 µL上清液进行PCR扩增。如果DNA浓度太高，需要用超纯水或10mM Tris‑HCl(PH 8.0)作为稀释液，吸取部分DNA上清液稀释5‑10倍使用。
1.6 其余上清液可分几份保存至‑20℃及更低温度保存，尽量避免反复冻融。
2.试剂配制（试剂准备区）
2.1从‑15℃以下冰箱中取出试剂盒平衡到室温（20～25℃），预先溶解引物至工作浓度(10µM)，注意避免强光照射，待完全溶解后振荡混匀并低速离心10 s，使用低吸附吸头分液取样，避免试剂损失和浪费。
2.2根据待检测样本总数，设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照；样品每满7份，多配制1份)，每测试反应体系配制如下表：
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配置PCR体系
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20 µL反应体系
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2 x Fast Direct PCR Mix
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10 µL
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Forward Primer(10µM)
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0.4 µL
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Reverse Primer(10µM)
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0.4 µL
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ddH2O
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7.2 µL
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Final volume
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18 µL
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2.3在适当容积的无菌离心管中加入上述试剂，充分振荡混匀后2,000 rpm 离心10 s，按照18 µL/管分装量将试剂分装至八联PCR反应管中。
2.4 盖紧八联PCR反应管盖, 并注意做好相应标识（请标记在八联PCR反应管盖两端突出部位，切勿标记在八联PCR反应管盖中间，以免影响信号采集）。将PCR反应管转移至样本准备区，剩余试剂放回‑15℃以下冰箱冷冻保存。
3.加样（样本处理区）
将步骤1.2提取的DNA上清液、阳性质控品、阴性质控品各取2 µL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心，核酸加样过程中应避免污染。
4.PCR扩增（核酸扩增区）
推荐循环参数设置：
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循环数
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温度
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时间
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步骤
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1
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1 cycle
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94℃
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5 min
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预变性
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2
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30‑35Cycles
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94℃
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10 seconds
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变性
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55℃
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15‑20 seconds
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退火
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72℃
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20 seconds/kb
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延伸
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3
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1
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72℃
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2‑3min
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终延伸
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4
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∞
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4℃
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∞
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终止
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5.结果分析判定
反应结束，取5 µL反应产物，琼脂糖凝胶电泳检测。
6.注意事项
(1)所有操作严格按照说明书进行；
(2)试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完全混匀并短暂离心；
(3)反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；
(4)使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；
(5)样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；
(6)实验完毕后用10%次氯酸或75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；
本产品仅供科研用途，请勿用于人体及动物、临床诊断或作为食品、化妆品、家庭用品的添加剂等用途。
