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EDTA抗凝血液直接PCR试剂盒
EDTA Blood Direct PCR Kit

一.试剂盒组成、储存、稳定性：

Contents	Storage	P4401-100	P4401-500
		100T x 20 µL	500T x 20 µL
2 x Fast Direct PCR Mix	-20℃	1 mL	5 × 1 mL
Quick Extract Enzyme	-20℃	300 µL	1.5 mL
1 x红细胞裂解液	室温	50 mL	5 x 50 mL
Quick Extract buffer A	室温	8 mL	40 mL
Quick Extract buffer B	室温	8 mL	40 mL

二.产品介绍：
本试剂盒可以在15‑20分钟内，从微量抗凝全血中直接分离基因组DNA 用于PCR扩增检测。该方法不需要用复杂的仪器，以及各种专用的核酸基因组DNA提取试剂盒来提取纯化基因组DNA，该试剂盒也可以直接对提取好的基因组DNA进行PCR扩增。

三.产品特点：
1．Easy：快速制备的基因组DNA，可以用2 x Fast Direct PCR Mix直接上机检测。
2．Quick：可以在15‑20分钟内一步制备多种材料的基因组DNA。
3．Versatile：可以处理抗凝全血，唾液，口腔拭子，培养细胞和微量动物组织等多种样品。
4．Sensitivity：只需及其微量的基因组DNA即可反应。
5．Specificity：适用于各种PCR反应，扩增速度快，扩增产量高，具有高扩增效率、高扩增产量、高保真度等特点，可以快速、准确地对目的基因进行PCR扩增。

四.适用范围：
适用于微量抗凝全血的快速基因组DNA制备，用于PCR扩增，具有高扩增效率、高扩增灵敏度、高扩增特异性的特点，可以快速、准确地对目的基因位点进行PCR扩增。

五.储存条件：
Quick Extract buffer A和Quick Extract buffer B常温保存和运输，4℃长期保存，2 x Fast Direct PCR Mix 和Quick Extract Enzyme试剂‑20℃长期保存，避免反复冻融。

六.用户自备：
PCR仪，上下游引物，ddH2O

七.DNA准备:
微量抗凝全血DNA快速提取法：
1．新的PCR管中可加入如下样品：
取20‑80 µL抗凝全血，全血：1x红细胞裂解液(v:v)=1:3，混匀后裂解5‑10 min，PCR管和八联排用掌上离心机最高速离心5 min，96孔PCR板用台式离心机4,000 rpm离心3min，吸弃上清留管底白细胞团，彻底清除残留的红细胞杂质，重复以上步骤，10x红细胞裂解液吹打混匀，再红细胞裂解一次。
2．根据实验样品数量，预先配置下表反应体系，确保每个样品孔50‑80 µL Quick Extract buffer A和2 µL Quick Extract Enzyme，混匀后分配到PCR管，八联排或者96孔PCR板中，吹打混匀样品，确保样品分散悬浮。

反应体系	体积
Quick Extract buffer A	50‑80µL
Quick Extract Enzyme	2µL

3．对PCR仪设置反应程序： 

步骤	温度	时间	循环数
步骤I	65‑70℃	10‑15min	1
步骤II	98℃	5min	1
步骤III	4℃	∞	∞

4．排枪加入50‑80 µL Quick Extract buffer B，吹打混匀，微量离心管用高速离心机12,000rpm离心1 min，96孔PCR板用台式离心机4,000 rpm离心5 min。
备注：一般情况Solution A和Solution B(v:v)等体积反应最佳，微量抗凝全血样品加60‑80µL。
5．吸取离心后透明上清液转移到干净的PCR管或EP管中，取2µL上清液进行PCR扩增，DNA浓度太高时吸取部分上清液稀释5‑10倍使用。
6．其余上清液可分几份保存至‑20℃，尽量避免反复冻融。

八.PCR流程：
1．溶解引物，震荡混匀，短暂离心，将引物和mix溶液甩至管底；
2．按下列组份配制PCR反应液，将除模板以外的试剂混成mix，分装到PCR管内，最后加模板DNA，充分混合，短暂离心溶液至管底。

PCR体系	20 µL反应体系	50 µL反应体系
2 x Fast Direct PCR Mix	10 µL	25 µL
上游引物(10µM)	0.4 µL	1 µL
下游引物(10µM)	0.4 µL	1 µL
ddH2O	x µL	x µL
基因组DNA上清液	2‑3 µL	2‑3 µL
总体积	20 µL	50 µL

备注：DNA模板的添加量通常在30‑80 ng/µL，因不同种类的DNA模板中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时可进行梯度稀释，确定最佳的DNA模板添加量，一般情况加2 µL基因组DNA上清液。
3. 在PCR仪上进行如下反应：

步骤	温度	时间	循环数
预变性	94℃	5 min	1
变性	94℃	10 seconds	30‑35Cycles
退火	55℃	15‑20 seconds
延伸	72℃	20 seconds/kb
终延伸	72℃	2‑3min	1
终止	4℃	∞	∞

4. 结果检测：反应结束，取5 µL反应产物，琼脂糖凝胶电泳检测。

注意：本产品仅供研究用，请勿用于人体及动物、临床诊断或作为食品、化妆品、家庭用品的添加剂等用途。