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动物组织/细胞直接PCR试剂盒
Animal Tissue/Cell PCR Kit

一.试剂盒组成、储存、稳定性：

Contents	Storage	P4403-100	P4403-500
		100T×20µL	5 x 100T×20µL
2 x Fast Direct PCR Mix	-20℃	1 mL	5 x 1 mL
Quick Extract buffer A	室温	4 x 2 mL	5 x 8 mL
Quick Extract buffer B	室温	5 x 2 mL	5 x 10 mL

二.产品介绍：
本试剂盒可以在15‑20分钟内，从唾液，口腔拭子，培养细胞，头发毛囊和微量动物组织中直接分离基因组DNA 用于PCR扩增检测。该方法不需要用复杂的仪器，以及各种专用的核酸基因组DNA提取试剂盒来提取纯化基因组DNA，该试剂盒也可以直接对提取好的基因组DNA进行PCR扩增。

三.产品特点：
1．Easy：快速制备的基因组DNA，可以用2 x Fast Direct PCR Mix直接上机检测。
2．Quick：可以在15‑20分钟内一步制备多种材料的基因组DNA。
3．Versatile：可以处理唾液，口腔拭子，培养细胞和微量动物组织等多种样品。
4．Sensitivity：只需及其微量的基因组DNA即可反应。
5．Specificity：适用于各种PCR反应，扩增速度快，扩增产量高，具有高扩增效率、高扩增产量、高保真度等特点，可以快速、准确地对目的基因进行PCR扩增。

四.适用范围：
适用于唾液，口腔拭子，培养细胞，头发毛囊和微量动物组织的快速基因组DNA制备，用于PCR扩增，具有高扩增效率、高扩增灵敏度、高扩增特异性的特点，可以快速、准确地对目的基因位点进行PCR扩增。

五.储存条件：
‑20℃长期保存，避免反复冻融。

六.用户自备：
PCR仪，上下游引物，ddH2O。

七.DNA准备:
组织细胞基因组DNA快速制备：
1．新的PCR管，8联排，EP管或者96孔板中可加入如下样品：

样品类型	样品处理方式
口腔拭子	准备1.5 mL EP管，口腔拭子浸泡于500‑800 µL生理盐水中，旋涡震荡30s后浸泡3‑5min，将拭子贴离心管壁挤干液体，13,000 rpm离心2‑3min，吸弃上清留管底脱落细胞。
唾液	50‑100 µL唾液13,000 rpm离心2‑3，吸弃上清留管底细胞团。
头发毛囊	取至少不低于5根头发毛囊，Buffer A体积50 µL，Buffer B体积50 µL。
培养细胞	5‑10 µL 细胞（浓度105‑107），1 x PBS重悬漂洗，13,000 rpm离心1 min，吸弃上清留管底细胞，细胞数量太少时取20‑50 µL 离心去上清。
动物组织	取厚度约2 mm，长宽约2‑3 mm的动物组织块，如鼠尾，鼠耳，鱼肉或鱼鳍，肌肉等动物组织，样品不宜太多。

2．每个样品孔加50‑80 µL Quick Extract buffer A，吹打混匀样品，确保样品分散悬浮。    

反应体系	体积
Quick Extract buffer A	50‑80 µL

3．对PCR仪或者金属浴设置反应程序：普通样品65‑70℃加热10‑15 min，98℃加热10‑15min，难裂解的动物组织样品65‑70℃，20‑30 min，98℃加热10‑15 min，冰浴冷却。
普通样品(唾液，口腔拭子，培养细胞)：

步骤	温度	时间	循环数
步骤1	65‑70℃	10‑15 min	1
步骤2	98℃	10‑15 min	1
步骤3	4℃	∞	∞

难裂解的动物组织样品(组织样品)：

步骤	温度	时间	循环数
步骤1	65‑70℃	20‑30min	1
步骤2	98℃	10‑15min	1
步骤3	4℃	∞	∞

4．加入50‑80 µL Quick Extract buffer B，吹打混匀，微量离心管13,000 rpm离心1‑2 min，台式离心机离心96孔板，4,000 rpm离心5 min。
备注：一般情况Solution A和Solution B(v:v)等体积反应最佳，但由于组织样品的不同，Buffer A和Buffer B体积可以稍微调整，头发毛囊加50 µL，唾液，口腔拭子和培养细胞样品加60 µL，动物组织样品A buffer加80µL，B buffer加80‑100 µL)。
5．吸取离心后透明上清液转移到干净的PCR管或EP管中，取2 µL上清液进行PCR扩增。如果DNA浓度太高，需要用TE buffer(PH 8.0‑8.5)或10mM Tris‑HCl(PH 8.0‑8.5)，吸取部分上清液稀释5‑10倍使用。
6．其余上清液可分几份保存至‑20℃，尽量避免反复冻融。

八.PCR流程：
1.溶解引物，震荡混匀，短暂离心，将引物和mix溶液甩至管底；
2.按下列组份配制PCR反应液，将除模板以外的试剂混成mix，分装到PCR管内，最后加模板DNA，充分混合，短暂离心溶液至管底。

PCR体系	20 µL反应体系	50 µL反应体系
2xDirect‑PCR Mix	10 µL	25 µL
上游引物(10µM)	0.4 µL	1 µL
下游引物(10µM)	0.4 µL	1 µL
ddH2O	x µL	x µL
基因组DNA上清液	1‑2 µL	2‑3 µL
总体积	20 µL	50 µL

备注：DNA模板的添加量通常在30‑80 ng/µL，因不同种类的DNA模板中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时可进行梯度稀释，确定最佳的DNA模板添加量，一般情况加2 µL基因组DNA上清液。
3.在PCR仪上进行如下反应：

步骤	温度	时间	循环数
预变性	94℃	5 min	1
变性	94℃	10 seconds	30‑35Cycles
退火	55℃	15‑20 seconds
延伸	72℃	20 seconds/kb
终延伸	72℃	2‑3min	1
终止	4℃	∞	∞

4.结果检测：反应结束，取5 µL反应产物，琼脂糖凝胶电泳检测。

注意：本产品仅供研究用，请勿用于人体及动物、临床诊断或作为食品、化妆品、家庭用品的添加剂等用途。