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培养细胞直接PCR试剂盒
Cell Direct PCR Kit

一.试剂盒组成、储存、稳定性：

Contents	Storage	P4407‑100	P4407‑500
		100T x 20 µL	500T x 20 µL
2 x Fast Direct PCR Mix	-20℃	1 mL	5 mL
Quick Extract buffer A	-20℃	8 mL	40 mL
Quick Extract buffer B	-20℃	8 mL	40 mL

二.产品介绍：
本试剂盒可以在15‑20分钟内，从培养细胞中直接分离基因组DNA 用于PCR扩增检测。该方法不需要用复杂的仪器，以及各种专用的核酸基因组DNA提取试剂盒来提取纯化基因组DNA，该试剂盒也可以直接对提取好的基因组DNA进行PCR扩增。

三.产品特点：
1．Easy：快速制备的基因组DNA，可以用2 x Fast Direct PCR Mix直接上机检测。
2．Quick：可以在15‑20分钟内一步制备多种材料的基因组DNA。
3．Versatile：可以处理唾液，口腔拭子，培养细胞和微量动物组织等多种样品。
4．Sensitivity：只需及其微量的基因组DNA即可反应。
5．Specificity：适用于各种PCR反应，扩增速度快，扩增产量高，具有高扩增效率、高扩增产量、高保真度等特点，可以快速、准确地对目的基因进行PCR扩增。

四.适用范围：
适用于培养细胞的快速基因组DNA制备，用于PCR扩增，具有高扩增效率、高扩增灵敏度、高扩增特异性的特点，可以快速、准确地对目的基因位点进行PCR扩增。

五.储存条件：
‑20℃长期保存，避免反复冻融。

六.用户自备：
PCR仪，上下游引物，ddH2O

七.DNA准备:
1.新的PCR管，8联排，EP管或者96孔板中可加入如下样品：
收集5‑10 µL培养细胞(浓度10⁵‑10⁷)，1 x PBS重悬漂洗，13,000 rpm离心1min，吸弃上清留管底细胞，彻底去除残留的培养基和PBS溶液。

2.每个样品孔加50‑80 µL Quick Extract buffer A，吹打混匀样品，确保样品分散悬浮。

3.对PCR仪设置反应程序：
细胞样品65‑70℃加热10‑15 min，98℃加热10‑15min。

普通样品(培养细胞)：

步骤	温度	时间	循环数
步骤1	65‑70℃	10‑15 min	1
步骤2	98℃	10‑15min	1
步骤3	4℃	∞	∞

4.每个样品加入50‑80 µL Quick Extract buffer B，吹打混匀，微量离心管13,000 rpm离心1‑2 min，台式离心机离心96孔板，4000 rpm离心5 min。
备注：一般情况Solution A和Solution B(v:v)等体积反应最佳，但由于组织样品的不同，Buffer A和Buffer B体积可以稍微调整，培养细胞样品加60 µL。

5.吸取离心后透明上清液转移到干净的PCR管或EP管中，取2 µL上清液进行PCR扩增，DNA浓度太高时吸取部分上清液稀释5‑10倍使用。

八.PCR流程：
1、溶解引物，震荡混匀，短暂离心，将引物和mix溶液甩至管底；

2、按下列组份配制PCR反应液，将除模板以外的试剂混成mix，分装到PCR管内，最后加模板DNA，充分混合，短暂离心溶液至管底。

PCR体系	20 µL反应体系	50 µL反应体系
2xDirect‑PCR Mix	10 µL	25 µL
上游引物(10µM)	0.4 µL	1 µL
下游引物(10µM)	0.4 µL	1 µL
ddH2O	x µL	x µL
基因组DNA上清液	1‑2 µL	2‑3 µL
总体积	20 µL	50 µL

备注：
a.DNA模板的添加量通常在30‑80 ng/µL，因不同种类的DNA模板中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时可进行梯度稀释，确定最佳的DNA模板添加量，一般情况加2 µL基因组DNA上清液。

b.上下游引物终浓度在0.1‑1 µM范围内优化，扩增效率不高的情况下，可提高引物的浓度，发生非特异性反应时，可降低引物浓度，由此优化反应体系。

3、在PCR仪上进行如下反应：

步骤	温度	时间	循环数
预变性	95℃	3‑5min	1
变性	95℃	10‑20s	30‑35Cycles
退火	55℃(Tm增加2‑5℃)	15‑20s
延伸	72℃	20s/1kb
终延伸	72℃	2‑3min	1
终止	4‑8℃	∞	∞

结果检测：反应结束，取5 µL反应产物，琼脂糖凝胶电泳检测。