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RT‑Exo RNA恒温快速扩增试剂盒(荧光型)
RT‑Exo RNA Isothermal Amplification kit(42℃)

一.原理概述
本试剂盒基于一种常温恒温核酸快速扩增技术：在常温恒温下，特殊修饰的反转录酶利用特异性引物DNA和模板RNA合成cDNA链，反应体系中的重组酶、单链DNA结合蛋白和DNA聚合酶以新合成的cDNA链为模板进行快速核酸扩增反应。本试剂盒在42 ºC下，依赖核酸外切酶的作用，加入根据模版设计的特异的分子探针，使用荧光监测设备能实现对目标片段扩增过程的实时监控。适用于实验室级别的RNA扩增以及其他检测用途的RNA扩增使用。

二.产品特点
本试剂盒具有灵敏度高、特异性强、反应时间短（仅需20 mins）等优点，反应组分为干粉状态，操作简便，易于保存。
适用于各种品牌的荧光定量PCR仪，恒温荧光扩增仪器等荧光检测设备。

三.引物设计
1. 建议使用长度在30‑35 bp的引物，引物过长或过短会影响扩增速度和检测灵敏度（特殊情况下设计较长引物比较困难的序列，引物长度可缩短至25 bp，但最好不少于25 bp）；
2. 碱基排布随机性高，GC 含量在 30%‑70%之间；
3. 引物设计避免形成二级结构而影响扩增；
4. 引物Tm值不作为设计时主要考虑因素；
5. 扩增子长度建议在150‑300 bp，通常不超过500 bp。
6. 最佳引物对需通过试验优化筛选，要求其扩增产物为单一条带，无非特异性扩增和明显的引物二聚体。

四.荧光探针设计
1.在上下游引物中间，设计一段长度为 46‑52nt 与目的片段互补的序列作为荧光探针；
2.探针序列不与特异性引物识别位点重叠，长度为46‑52 nt，序列避免回文序列、内部二级结构和连续的重复碱基。
3.探针共有四个修饰位点：
1). 距离 5’端的 30‑35 nt 的中部位置标记一个 dSpacer（四氢呋喃，THF），作为核酸外切酶的识别位点（任何碱基，无特殊要求）；
2). THF 位点的上游的 T 碱基上标记一个荧光基团（如 FAM），下游在 T 碱基上标记一个淬灭基团（如BHQ1），两个基团的间距为 2‑4 nt；
3). THF 距离 3’末端约 15 nt，并且 3’末端标记一个修饰基团，例如胺基、磷酸基团或 C3‑spacer。

探针序列：



探针修饰：
ATGGCTATCATATCGCATAACTGCCGACAG[FAM‑dT]AG[THF][BHQ1‑dT]CTCAAAGATGGACC[C3‑spacer]‑3’

五.试剂盒组成：

产品组成	包装规格
A Buffer	1.5 mL×1管
B Buffer	200 μL×1管
干粉反应管	48份(6个8联排)
使用说明书	1份

六.试剂盒储存：
运输条件：低温运输；产品有效期：12个月。
储存条件：储存温度 ≤ ‑20 ºC，避光保存，避免重压、反复冻融；

七.操作步骤：提前30分钟将试剂盒所需组分取出，室温融化，震荡混匀。
1.根据待检测样本总数，设所需要的反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照)，每测试反应体系配制如下表：

组分	待测样品	空白对照
干粉反应管	1 管	1 管
A Buffer	25 μL	25 μL
上游引物(10 μM)	2 μL	2 μL
下游引物(10 μM)	2 μL	2 μL
探针引物(10 μM)	0.6 μL	0.6 μL
ddH2O	12.9 μL	12.9 μL
RNA模板	5 μL	加水5 μL
A Buffer	2.5 μL	2.5 μL
总体积	50 μL	50 μL

2.在1.5 mL无菌离心管中加入上述试剂，充分振荡混匀后瞬时离心10sec，按照42.5 
μL/管分装量，将试剂分装至八联排干粉反应管中。

3.将待测样品DNA、空白对照ddH2O各取5 μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，核酸加样过程中应避免污染。

4.最后在反应管盖子中加入2.5 μL的B Buffer，盖上管盖，上下颠倒轻甩反应管8‑10次进行混匀，充分混匀后瞬时离心10 sec；(注：是否充分混匀，将决定实验结果的重复性)

5.立即将反应管放入荧光检测设备中，荧光检测程序设置为：恒温42 ºC预热1 min，恒温扩增42ºC，30sec/循环，40个循环，每30 sec采集一次FAM通道（信号采集通道的选择与荧光探针设计一致）荧光值；反应时间21‑25 min。 注：如使用ABI系列PCR仪，请务必于passive reference和quencher处均选择“none”。 

步骤	循环数	温度	时间/循环	收集荧光信号
预热	1 cycle	42℃	1 min	否
扩增	40 cycle	42℃	30 sec	是

八.结果分析判定
一般直接按机器自动分析的结果分析，参照具体荧光定量PCR仪使用说明书进行基线设定和阈值设定。
阳性：出峰时间≤18 min，检测通道Ct值≤36，且曲线有明显的指数增长曲线。
可疑：出峰时间>18 min，检测通道Ct值>36，且出现典型扩增曲线的样本建议重复试验。
阴性：出峰时间≥20 min，检测通道Ct值>40，或检测结果无Ct值，无明显扩增曲线。

九.注意事项
1.试剂盒保质期12个月。每次使用时，请取出实验所需的反应单元的数量，置于冰浴条件下并在8小时内使用；剩余部分，请置于存储条件下。
2.当实验室环境、试剂、仪器或配件存在阳性物质污染，或样本间存在交叉污染的情况，则会影响检测结果准确性，出现假阳性结果；
3.由于试剂盒灵敏度非常高，在进行反应时请注意避免微量待扩增RNA污染，并尽量考虑设置空白对照以确认是否有待扩增RNA的污染。
4.请严格按照本说明书和基因扩增实验室的管理规范进行试验操作；
5.样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；
6.实验完毕后用10%次氯酸或75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；
实验结束后，检测过程中所产生的废弃物应按照相关规范进行处理；