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RT-Exo RNA恒温快速扩增试剂盒(荧光型)

包装规格：

RNA扩增，荧光检测

一. 原理概述：
本试剂盒基于一种常温恒温核酸快速扩增技术：在常温恒温下，特殊修饰的反转录酶利用特异性引物DNA和模板RNA合成cDNA链，反应体系中的重组酶、单链DNA结合蛋白和DNA聚合酶以新合成的cDNA链为模板进行快速核酸扩增反应。本试剂盒在42 ºC下，依赖核酸外切酶的作用，加入根据模版设计的特异的分子探针，使用荧光监测设备能实现对目标片段扩增过程的实时监控。适用于实验室级别的RNA扩增以及其他检测用途的RNA扩增使用。

二. 产品特点：
本试剂盒具有灵敏度高、特异性强、反应时间短（仅需20 mins）等优点，反应组分为干粉状态，操作简便，易于保存。
可适用于各种品牌的荧光定量PCR仪，恒温荧光扩增仪器等荧光检测设备。

三. 引物设计：
1. 建议使用长度在30-35 bp的引物，引物过短会影响扩增速度和检测灵敏度；
2. 碱基排布随机性高，GC 含量在 30%-70%之间；
3. 引物设计避免形成二级结构而影响扩增；
4. 扩增子长度建议在150-300 bp，通常不超过500 bp。

四. 荧光探针设计：
在上下游引物中间，设计一段长度为 46-52nt 与目的片段互补的序列作为荧光探针；
探针序列不与特异性引物识别位点重叠，长度为46-52 nt，序列避免回文序列、内部二级结构和连续的重复碱基。

探针共有四个修饰位点：
1. 距离 5’端的 30-35 nt 的中部位置标记一个 dSpacer（四氢呋喃，THF），作为核酸外切酶的识别位点（任何碱基，无特殊要求）；
2. THF 位点的上游的 T 碱基上标记一个荧光基团（如 FAM），下游在 T 碱基上标记一个淬灭基团（如BHQ1），两个基团的间距为 2-4 nt；
3. THF 距离 3’末端约 15 nt，并且 3’末端标记一个修饰基团，例如胺基、磷酸基团或 C3-spacer。

五. 试剂盒储存：
运输条件：低温运输；
储存条件：储存温度 ≤ -20 ºC，避光保存，避免重压、反复冻融；
产品有效期：12个月。 

六. 操作步骤：

提前30分钟将试剂盒所需组分取出，室温融化，震荡混匀。

1).每个干粉反应管加入32.9 μL A buffer（注意：A buffer需完全融化混匀，否则会对实验效果产生影响）；

2).每个反应管分别加入2 μL上游引物、2 μL下游引物和0.6 μL探针（引物和探针浓度为10 μM，对于多个反应、步骤1和步骤2可以混合后再分装至反应管中）；

3).向反应管中依次加入7 μL ddH2O和3 μL核酸RNA模板（可根据核酸浓度调整加入的核酸模板体积，并相应调整加入的ddH2O体积，至模板与ddH2O总体积为10 μL）；

4).最后向反应管中加入2.5 μL B Buffer并充分混合（对于多个反应，建议将B Buffer加至反应管的盖子内侧，上下颠倒反应管8-10次混匀）；

5).混匀后，将反应液甩（或快速离心）至管子底部，然后立即将反应管放入荧光检测设备中。荧光检测程序设置为：恒温42 ºC；每30 s采集一次FAM通道（信号采集通道的选择与荧光探针设计一致）荧光值；反应时间20 min。
注：如使用ABI系列PCR仪，请务必于passive reference和quencher处均选择“none”。