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RT‑Basic RNA恒温快速扩增试剂盒(基础型)
RT‑Basic RNA Isothermal Amplification kit(42℃)

一.原理概述
本试剂盒基于一种常温恒温核酸快速扩增技术：在恒温条件下（42 °C），特殊修饰的反转录酶利用特异性引物DNA和模板RNA合成cDNA链，反应体系中的重组酶、单链DNA结合蛋白和DNA聚合酶以新合成的cDNA链为模板进行快速核酸扩增反应。适用于实验室级别的RNA扩增以及其他检测用途的RNA扩增使用。

二.产品特点
本试剂盒具有灵敏度高、特异性强、反应时间短（仅需30 mins）等优点，反应组分为干粉状态，操作简便，易于保存。
本试剂对设备要求低，金属浴、水浴锅等即可进行反应操作，无需购买PCR扩增仪等价格高昂的专属设备。

三.引物设计
1. 建议使用长度在30‑35 bp的引物，引物过长或过短会影响扩增速度和检测灵敏度（特殊情况下设计较长引物比较困难的序列，引物长度可缩短至25 bp，但最好不少于25 bp）；
2. 碱基排布随机性高，GC 含量在 30%‑70%之间；
3. 引物设计避免形成二级结构而影响扩增；
4. 引物Tm值不作为设计时主要考虑因素；
5. 扩增子长度建议在150‑300 bp，通常不超过500 bp。
6. 最佳引物对需通过试验优化筛选，要求其扩增产物为单一条带，无非特异性扩增和明显的引物二聚体。

四.试剂盒组成：

产品组成	包装规格
A Buffer	1.5 mL×1管
B Buffer	200 μL×1管
干粉反应管	48份(6个8联排)
使用说明书	1份

五.试剂盒储存：
运输条件：低温运输；产品有效期：12个月。
储存条件：储存温度 ≤ ‑20 ºC，避光保存，避免重压、反复冻融；

六.操作步骤：提前30分钟将试剂盒所需组分取出，室温融化，震荡混匀。
1.根据待检测样本总数，设所需要的反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照)，每测试反应体系配制如下表：

组分	待测样品	空白对照
干粉反应管	1 管	1 管
A Buffer	25 μL	25 μL
上游引物(10 μM)	2 μL	2 μL
下游引物(10 μM)	2 μL	2 μL
ddH2O	13.5 μL	13.5 μL
分装体积	42.5 μL	42.5 μL

2.在1.5 mL无菌离心管中加入上述试剂，充分振荡混匀后瞬时离心10 sec，按照42.5 μL/管分装量，将试剂分装至八联排干粉反应管中。

3.将待测样品RNA、空白对照ddH2O各取5μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，核酸加样过程中应避免污染。

4.最后在反应管盖子中加入2.5 μL的B Buffer，盖上管盖，上下颠倒轻甩反应管8‑10次进行混匀，充分混匀后瞬时离心10 sec。(注：是否充分混匀，将决定实验结果的重复性)

5.立即将反应管放入恒温设备(恒温金属浴，恒温水浴锅和恒温培养箱)中42℃孵育30 min。

6.反应结束后，使用PCR产物纯化回收试剂盒纯化回收扩增产物，或者加入50 μL Tris饱和酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）抽提液，1:1抽提反应溶液，12,000 rpm离心5 min，最后取5 μL上清进行电泳检测。 

七.注意事项
1.试剂盒保质期12个月。每次使用时，请取出实验所需的反应单元的数量，置于冰浴条件下并在8小时内使用；剩余部分，请置于存储条件下。
2.当实验室环境、试剂、仪器或配件存在阳性物质污染，或样本间存在交叉污染的情况，则会影响检测结果准确性，出现假阳性结果；
3.由于试剂盒灵敏度非常高，在进行反应时请注意避免微量待扩增RNA污染，并尽量考虑设置空白对照以确认是否有待扩增RNA的污染。
4.请严格按照本说明书和基因扩增实验室的管理规范进行试验操作；
5.样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；
6.实验完毕后用10%次氯酸或75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；
实验结束后，检测过程中所产生的废弃物应按照相关规范进行处理；